생물화학공학이론및 실험_ Miniprep_PCR_Restriction_Transformation_Liquid culture_Enzyme activity 전 실험 과정 통합 이론_ 예비레포트 [A+]

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목차

1. 실험 목적
2. 바탕 이론
3. 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 참고 문헌

본문내용

되며, 즉 투과율의 음의 상용로그 값으로 정의된다. 일반적으로 물체에 빛을 흡수하는 입자가 많다면 투과되어 나오는 빛의 세기는 줄어들기 때문에 흡광도는 물질의 농도에 영향을 받고, 또 입자가 어느 정도의 빛을 흡수하느냐에 따라 그 값이 달라지기 때문에 물질의 흡수도에도 영향을 받는다. 또한 빛이 통과한 거리도 영향을 주는 요인이 될 수 있다. 빛이 통과해야하는 거리가 길어질수록 빛의 세기가 약해지기 때문이다. 이러한 흡광도를 알아봄으로써 세포의 성장을 확인할 수 있다. 미생물 세포가 빛을 산란하는 것을 이용해 분광광도계를 이용해 빛이 산란되는 정도를 세균의 농도와 정비례하는 OD를 측정한다. 각 세포에 들어있는 물질의 양이 일정하다고 가정하면 특정한 세포의 구성 총량은 그 세포의 질량에 비례하기 때문에 일정 부피 배양에서 세포를 회수하고 세척한 뒤 전체 단백질이나 질소의 양을 측정하면 전체 세포수를 측정할 수 있다.
FIg 8. 흡광도
( : 전체 복사량=투과 전 빛의 세기, : 투과량=투과 후 빛의 세기,
: 몰 흡수계수=, : 빛의 투과거리, : 용액에 녹아있는 용질의 몰농도)
3. 기구 및 시약
(1) 실험 시약
① Candida antarctica lipase B solution (CalB)
② 50mM p-nitrophenyl butyrate (pNPB)
Fig 9. CalB
- 지방가수분해효소인 lipase의 한 종류로, p-NPB의 분해 반응을 돕는 효소이다. 또한 지방의 ester기 수화반응을 유도할 수 있으며, 반대로 ester화 반응에도 관여할 수 있다.
Fig 10. p-NPB
- 화학식 :
- 분자량 : 209.2g/mol
- MSDS :
- 이번 실험에서 lipase 효소의 기질로 사용되며, 가수분해되어 노란색을 띠는 p-nitrophenol을 생성한다.
③ 50mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)
④ DDW (Double Distilled Water)
Fig 11. Tris-HCl buffer
- Tris ()에 을 첨가해 pH를 조절해 생물체 내의 pH와 비슷한 7.5 정도로 만든 완충용액이다. 완충작용을 통해 pH를 일정하게 유지하게 해준다.
Fig 12. DDW
- 2차 증류수로, 이번 실험에서는 UV-Vis spectrophotometer의 zero point를 맞출 때 사용한다.
(2) 실험 기구
① Micropipette 5ml, 1ml, 10μl
② Cuvette
Fig 13. 마이크로피펫
- 미량 분석에서 이용되는 미량 액체의 부피를 정확하게 채취, 배출시키기 위한 기기이다.
Fig 14. Cuvette
- 액체에 대한 빛의 흡수를 측정할 때 측정할 시료를 넣는 용기이다.
③ UV spectrophotometer (분광광도계)
④ Shaking incubator (진탕배양기)
Fig 15. 분광광도계
- 자외선 파장을 조사하여 물질의 광 흡수 현상을 이용해 미지의 시료가 흡수하는 빛의 파장과 그때의 흡광도를 측정하는 장치
Fig 16. Shaking incubator
- 미생물을 접종한 액체 배지를 흔들어 그 움직임으로 공기 중의 산소의 이동을 촉진시켜 배양하는 장치이다. 이번 실험에서는 호기성 균 및 세포의 배양을 위해 사용한다.
⑤ 250ml laboratory bottle
(= Duran bottle )
⑥ Aluminium foil
Fig 17. Duran bottle
- 시약 및 샘플 보관에 사용하며, 변성이 되지 않는 실험용 유리용기이다.
Fig 18. Aluminium foil
- 포장재나 단열재로 쓰이며, 이번 실험에서는 p-NPB의 광분해를 방지하기 위해 사용된다.
4. 실험 방법
< 용액 제조 >
① 50mM Tris-HCl buffer 998μl + CALB 2μl
→ 500배 희석한 CALB 1ml
② Acetonitrile 9.912ml + p-NPB 0.088ml
→ 50 mM p-NPB 10ml
(1) 호일을 감싼 bottle 2개를 준비하여 각 bottle에 54.45 ml의 50mM Tris-HCl buffer와 0.55 ml의 50 mM p-NPB를 넣어 0.5 mM pNPB 용액을 만들고 vortexing한다. (※ 가능한 빛을 받지 않도록 한다.)
(2) 대조군으로 한 개의 bottle에는 효소를 넣지 않고, 다른 한 개의 bottle에는 500배 희석한 효소(calB)를 20 μL 넣어준다.
(3) 반응 전 1 ml를 sampling하여 반응의 초기값(0min)을 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 405 nm 파장대의 흡광도를 측정한다.
(4) 두 개의 bottle을 shaking incubator에서 40 ℃, 150rpm으로 반응시킨다.
(5) 10분, 20분, 30분, 40분 총 4번 흡광도를 측정하여 측정한 data를 바탕으로 Abs 405/min의 그래프를 그리고, 아래의 식을 이용하여 효소의 specific activity (U/mgenzyme )를 계산한다.
※ 실험 시 유의사항
- p-NPB는 광분해될 수 있으므로 호일로 감싸야 한다.
- 흡광도 측정할 때 UV-Vis spectrophotometer에 외부 빛이 들어가지 않도록 한다.
- Sampling할 때 정확한 흡광도 측정을 위해 cuvette에 지문이 묻지 않도록 주의한다.
- 측정한 흡광도가 1이 넘으면 시료를 희석하여 실험을 진행해야 한다.
5. 참고 문헌
- Charles N. Satterfield, Heterogeneous Catalysis in Industrial Practice,\" 2nd ed., McGraw-Hill, Inc. (1993).
- W Mantele, E Deniz, UV-VIS absorption spectroscopy :Lambert-Beer reloaded, Elsevier, 173 , page 965-968, (2017).
- Shimadzu., The Relationship Between UV-VIS Absorption and Structure of Organic Compounds, (2017).

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생물화학공학,   화학공학,   화학공학실험,   생물실험,   예비레포트,   Miniprep,   PCR,   Restriction,   Transformation