Cloning vector

목차

Ⅰ. Introduction

Ⅱ. Materials and apparatus

Ⅲ. Method

Ⅳ. Discussion

본문내용

i을 Ca2+ 이온 존재 하에 놓아두면 foreign DNA(plasmid, phage 등)를 세포 안으로 도입할 수 있는 competent상태로 되고, 이 상태의 세포를 competent cell이라 한다. 이때 사용하는 E.coli host cell을 competent cell이라고 부른다. 실험을 대략적으로 보면 우리는 효소가 발현, 활성을 띨 수 있는 조건을 맞춰준 E.coli host cell (competent cell)에 지난번에 사용한 ligation mixture 20μl를 ice에 30분간 반응시키고, 42°C에서 2분간 heat shock을 준 다음 1ml의 LB를 첨가하는데. 여기서 LB를 넣는 이유는 Ca2+ 때문에 cell이 약해져있어서 membrane에서 DNA uptake하기 힘들어 cell이 죽기 쉽기 때문이다. heat shock으로 열리면서 그 부분에 LB넣어주므로 상태가 좋아질 수 있다. 1ml은 너무 많기 때문에 centrifuge를 이용하여 cell down 시키고 pellet을 pipette으로 풀어준다. 그 다음 37°C에서 30분 정도 incubation 한 다음, LA배지에 loading을 해준다. 내가 실험한 LA배지를 보면 26개의 colony를 찾을 수 있었다. 하얀색으로 점 모양으로 퍼져있는데 이것으로 transformation된 cell이 자라있음을 알 수 있었다.
우리가 찾고자 하는 transformant는 amp auxotroph인 cell에서 heat shock을 주어 형질전환이 되어 LA배지에서 자랄 수 있는 amp+ cell을 얻는 것이다. 우리가 transformation을 selection maker로서 사용한 것은 항생제 ampicillin이다. 우선 LA배지에서 colony가 나와 transformation이 되었다 예상할 수 있었다.
그러나 원래의 실험에는 대조구로 plasmid 대신 동량의 멸균증류수를 이용하여 동일한 실험을 수행하여 transformation 수행한 배지와 transformation 수행하지 않은 대조구로 비교하여 차이점을 알아보는 과정이 있었다. 하지만 우리는 실험에서 대조구를 수행하지 않아서 정확한 차이는 비교할 수 없었다. 실험과정에 있어서는 이렇게 control을 잡아주는 게 절대적으로 중요하다. 이번 실험에서는 DNA를 다루는 실험에서는 유일하게 모든 과정을 무균조작으로 이루어 졌으며 만드는 과정의 여러 가지 factor가 competent cell의 transformation efficiency를 결정하므로 만드는 과정은 매우 신중하게 실험에 임했다. 한 가지 의문점은, 조교님께서 이번실험에서 transformant는 ligation한 DNA를 사용하였기 때문에 colony가 적게나올 것이라고 말씀하셨는데 몇몇 배지의 경우는 셀 수 없을 정도로 colony가 많이 나왔다. 이것은 transformation 효율이 좋아서 colony가 많이 나온 것인지 아니면 실험 중에서의 오류로 많은 cell이 자란 것인지는 의문으로 남는다.

키워드

Cloning vector,   vector,   제한효소,   플라스미드