TLC[thin-layer chromatography]얇은막 크로마토그래피

본문내용

원인이 될 수 있다고 추정하였다. 위의 TLC판을 살펴보면 TG의 중간에 Spot들이 생긴 것을 확인할 수 있는데 불순물의 영향을 받아 유리지방산과 결합된 탓에 나타나는 것이다.
얇은 층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)는 깨끗한 유리판 위에 흡착제 알맹이의 층을 만들어 용제증기를 포화시킨 공기 중에 세우고 한 끝을 용제 속에 담구어 모세관현상으로 용제를 위쪽으로 이동시키면 판 아래쪽에 부착시켜 놓았던 시료는 흡착제를 정지상, 용제를 이동상으로 해서 혼합성분이 크로마토그래프적으로 전개되어 분리시키는 것을 원리로 하는 분리방법이다. TLC에 있어서 고정상은 불활성 지지체에 입자성 물질을 한 층으로 입힌것이며 지지체는 초기에 주로 유리를 사용했으나 지금은 주로 플라스틱이나 알루미늄을 사용한다. 상업적으로나 실험실에서 만들어지는 판은 고정상으로 지지물질이나 결합제를 용매로 사용하여 표면처리하고 상온이나 오븐에서 말려서 제작한다. 크로마토그래피의 분리 능력은 고정상의 입자크기에 의존하므로 TLC에서 입자크기 분포를 좁히며 평균입자크기를 5㎛ 감소시키면 어느 정도 증가된 분리력을 얻을 수 있다. TLC는 크로마토그래피의 특정 방식에 제한되지 않고 분석하고자 하는 물질의 안정한 층을 찾을 수 있게 하였다. 가장 흔히 접할 수 있는 고정상은 실리카겔인데 이는 극성에 따른 용매의 강도 변화로 광범위한 혼합물을 분리 할 수 있다. 한 쪽 끝에는 triacylglycerol이 hexane, diethyl ether와 같은 용매로 분리될 수 있고, 다른 끝에서는 sulphonic acid와 같은 극성 물질이 수성알코올과 같은 극성 용매로 염색된다. 이러한 TLC의 장점과 단점을 살펴보자. 일단 장점은 종이크로마토그래피에 비해 전개 시간이 짧고(30~60분) 시료 반점(spot)이 매우 작기 때문에 뛰어난 해상력을 보여 분리능률이 양호하다는 것이다. 또 강한 산 강한 염기나 강렬한 시약 등을 발색시약으로 사용할 수 있으며 비극성 물질을 분리할 수 있고, 유기화합물의 분리 정제 정량 순도 검정, 반응이나 대사과정의 추적, 무기이온분석 등 응용범위가 넓다. 그리고 매우 손쉽고 빠르게 할 수 있어서 혼합물 조성의 1차적인 분석방법으로 사용되고 관 크로마토그래피(Column Chromatography)를 위한 최적의 elution solvent를 찾는데도 유용하게 사용되며 특히 아주 적은 양으로도 시료를 분석할 수 있는 점이 좋다. 그러나 단점은, 색깔이 있는 물질의 경우에는 크로마토그래피(chromatography)상의 반점을 알아보기 쉽지만 무색의 물질일 경우는 반점의 위치를 확인하기 위하여 발색제를 뿌려주던가 자외선을 쬐어서 형광을 발하게 하는 등의 수단을 사용하여야 하는 불편함이 있다. 또 흡착제의 조건을 맞춰주어야 하고, 흡착제의 조건은 산성이나 염기성이 크지 않는 무색 무기질이어야 하고, 물질과 화학 반응이 일어나지 않는 것, 물질에 대한 흡착력이 크고 입자의 크기가 균일한 것이어야 만 한다.
그렇다면 위와 같이 Rf값이 다 다르게 나타나는 이유는 무엇일까? 그것은 표준물질이 가지고 있는 구조상의 차이 때문이다. 각 시료의 구조와 특징을 살펴보자. 첫 번째로 TG(Triglyceride)는 한 분자의 글리세롤에 세 분자의 지방산이 에스테르 결합되어 있는 구조로 아래의 <그림8>과 같다. TG는 비극성을 띈다. 두 번째로 MG(Monoglyceride)는 한 분자의 글리세롤에 한 분자의 지방산이 에스테르 결합되어 있는 구조로 아래의 <그림9>와 같다. 두 개의 알콜기를 가지기 때문에 강한 극성을 띈다. 세 번째로 Cholesterol은 <그림10>과 같이 steroid의 유도체로 가장자리에 알콜기를 가지며 그로 인해 극성을 띈다. 네 번째로 Oleic acid는 <그림11>와 같이 단일불포화지방산으로 C=C결합을 가지고 있고 이는 왼쪽에서 9번째 부분에서 불포화되며 오메가-9 지방산으로 언급된다. 다섯 번째로 Linoleic acid는 <그림11>과 같이 다중불포화지방산으로 오메가-6 지방산으로 언급되며 두 개의 C=C결합을 가진다. Linoleic acid가 Oleic acid보다 더 극성을 나타내는데, 이는 이중결합은 반응성이 커서 산패가 일어나기가 쉽게 되며 이러한 산패는 극성의 성질에 영향을 미쳐 두 개의 이중결합을 가지고 두 번 꺾인 구조인 Linoleic acid가 더 극성이 되는 것이다.
<그림8> TG(Triglyceride)
<그림9> MG(Monoglyceride)
<그림10> Cholesterol
<그림11> Cholesterol
<그림12> Cholesterol
우리는 본 실험에서 전개된 TLC판에 황산을 뿌려 발색제로 이용하였다. 이는 어떤 원리인지 알아보겠다. 발색제란 발색제 그 자체에는 색이 없으나 식품 중의 색소와 작용해서 색을 안정시키거나 발색을 촉진시키는 물질을 일컫는 말로 많은 종류의 발색제가 있는데, TLC 실험에서는 UV lamp, Dragendorff, 황산 등의 발색제가 쓰인다. 첫째, UV lamp는 TLC판에 형광물질이 발라져 있는 것을 사용했을 경우 사용가능한 방법이다. TLC를 전개시킨 후 UV(자외선)을 쬐어 주면 시료 간 올라간 점은 색깔을 보이게 된다. 둘째, Dragendorff는 잘 사용하지 않는 방법으로서 보통 천연물의 확인에 사용한다. 그리고 사용 전 바로 두 용액을 섞어서 사용하고 조금 지나면 효과가 없기 때문에 잘 사용하지 않는다. I₂발색은 TLC판을 밀폐된 병에 넣고 I₂(요오드)를 넣어주게 되면 시료가 색을 띠게 된다.셋째, 황산은 TLC를 전개시킨 후 5% 황산성에탄올용액(황산 5g + 에탄올 95g)을 뿌려 준 후 고온(약 200~300도씨)에서 태우면 시료부분이 검게 보이게 된다. 화합물의 탄소성분을 황산으로 회화시켜 검게 만드는 것이 원리이다.
Reference
「쉬운 식품분석」, 이근보외, 유한문화사, 2006년, P252~256, 310~312
「식품화학」, 윤석권외, 수학사, 2004년, P190
「식품분석실험」, 조형용외, 광문각, 2003년, P264~266

키워드

TLC ,   크로마토그래피,   chromatography,   식품,   화학,   분석,   실험