[생화학 실험] PCR-mediated mutagenesis

목차

1. 실험제목
2. 실험일자
3. 제출자
4. 목적
5. 원리
6. 재료 및 기자재
7. 결과
8. 고찰
9. 숙제
10. 참고문헌

본문내용

primer는 소비되어 버리고 과잉의 primer에서 single strand DNA가 생성된다.
(h) Nest PCR
한번 PCR로 증폭한 DNA 단편을 한번 더 내부의 primer를 사용하여 증폭하는 방법이다. 이는 비 특이적 반응을 감소 시키며, PCR을 2회 실시하므로 감도가 상승하는 효과를 얻을 수 있다.
(i) ISPCR(In Situ Polymerase Chain Reaction)
PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 sensitivity와 ISH의 specificity를 고루 갖추고 있다. ISPCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, slide glass 등의 사용에 적합한 ISPCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.
(j)DDRT-PCR(Differential Display Reverse Tran***ase PCR) : 각각의 세포에서 특정하게 발현되는 mRNA를 찾아낼 때.
(k)RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) : cDNA를 cloning후 ORF screening할 때.
2)Site-directed mutagenesis 를 왜 할까?
단백질의 기능 및 역할을 규명하는데 있어서 분자세포 생물학에서 많이 이용되고 있는 site-directed mutagenesis는 DNA 염기서열을 치환, 삽입 그리고 제거를 통해 단백질의 기능을 규명하는데 그 목적이 있다. 일반적으로 의심되는 단백질의 motif부분을 염기서열의 변화를 통해 다른 아미노산으로 치환함으로써 단백질의 motif 기능의 활성 여부로 인하여 gene function을 알 수 있다.
3) 어떤 아미노산을 주로 사용하는가?
error-prone PCR에 의한 무작위 돌연변이는 point mutation을 유도한다. 그러나 특정 목표 단백질의 모든 아미노산들이 같은 비율로 교환이 되지 않는데, 이러한 이유로는 20개의아미노산을 인코딩하는 61개의 코돈과 stop 코돈으로서 사용되는 3개의 코돈을 갖는 유전자 코드의 퇴화 때문이다. 20개 아미노산중 오직 2개의 아미노산이 단일 코돈에 의해 지정이 되는데, 그 예로서 UGG에 의한 Trp 그리고 AUG에 의한 Met가 그것이다. 반면에 다른 아미노산인 Leu, Ser, Arg는 각각 6개의 다른 코돈들에 의해 인코딩된다. 이러한 결과로서ep-PCR 에 의해 유도되는 모든 염기치환의 약 1/3은 아미노산 치환이 되지 않는다. 더구나 단일코돈에서 2-3개의 염기치환의 경우는 낮다. 트리플랫(triplet)에서 1 염기쌍을 바꿈에 의해 9개의 다른 코돈이 생길 수 있는데, 예를들면 오직 적은 수의 아미노산만이 효소의 주어진 위치에서 유도될 수 있다. Pseudomonas aeruginosa 리파아제 (285-아미노산 단백질)에 유도될 수 있는 아미노산 교환은 단일염기 치환에 의해 생산될 수 있는 변이체의 실제 수는 이론적으로 34%밖에 되지 않는다(Chem. Biol., 7, 709(2000)). 이러한 문제는 부분적으로 site-specific saturation mutagenesis를 응용함으로서 보완이 될 수 있는데, 유전자에 미리 정해진 위치에 모든 가능한 아미노산을 도입하는데 이용될 수 있다. 무작위 돌연변이, 스크리닝, DNA서열분석의 첫단계에서 흥미있는 특성을 향상시키기 위해 중요한 위치들이 확인될 수 있다. 그러한 hot spots는 최적의 아미노산이 이전 단계의 무작위 돌연변이에 의해 도입이 제대로 되었는지 알아내기 위해 site-specific saturation mutagenesis에 필요하다.
Reference
-생화학실험(2) 전반부 실험교본
-http://blog.daum.net/skadkfl3/2963199
-http://en.wikipedia.org/wiki/Site-directed_mutagenesis
-www.genehunters.co.kr
-http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/site_directed_muta. php
-http://blog.naver.com/shanti78/40017326354

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mutagenesis,   PCR,   돌연변이 형성,   생화학 실험,   생물 실험,   실험,   실험레포트