[기초유전학실험]7.Reverse transcription polymerase chain reaction

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5. Discussion
6. Reference

본문내용

7289
1722
40℃ 4h heat shock 당근 잎
12260
16124
40℃ 12h heat shock 당근 잎
12151
23188
[ Table 5. sample 별로 계산 ]
sample
계산
control
1722 / 17289 = 0.0996
40℃ 4h heat shock 당근 잎
16124 / 12260 = 1.3151
40℃ 12h heat shock 당근 잎
23188 / 12151 = 1.9083
[ Figure 2. 계산값의 막대그래프 ]
[ Table 6. Control을 기준으로 환산값 ]
sample
환산값
control
1
40℃ 4h heat shock 당근 잎
1.3151 / 0.0996 = 1.32
40℃ 12h heat shock 당근 잎
1.9083 / 0.0996 = 1.92
[ Figure 3. 환산값의 막대그래프 ]
5. Discussion
실험결과 1반 2반 모두의 실험에서 결과가 제대로 나오지 않아서 조교님이 했던 실험결과를 토대로 결과 값을 측정해보았다. 3개의 sample 모두 cDNA 상태이고 이 cDNA 안에는 actin과 HSP gene이 모두 들어있는 상태이다. (mRNA 추출할 때부터 actin mRNA, HSP mRNA 모두 추출되고 이것을 cDNA로 바꾸는 과정에서 oligo dT primer를 사용하였기 때문에 모든 mRNA가 cDNA로 바뀌게 되었다. 그러므로 각각 sample의 cDNA에는 actin과 HSP가 모두 포함되게 된다). 그래서 primer에 따라 PCR 결과가 달라지는 것이다. 즉 actin primer를 사용하는 경우 결과의 사진처럼 actin band가 잡히는 것이고 HSP primer를 사용하는 경우 아래의 사진처럼 HSP band가 잡히는 것이다.
실험에서 기계를 통해 정량 값을 알아본 뒤 sample별로 나온 HSP gene의 정량 값을 actin gene 정량 값으로 나누어 막대그래프로 표시하였다. 기계를 통해 나온 정량 값은 단순히 숫자 값이 엇비슷한 정도이지 100%일치하는 것이 아니기 때문에 어떤 것이 더 발현이 잘 되었는지 숫자적으로 알 수 있게 하기 위하여 해준 것이다. 이는 숫자에 대한 신뢰도를 높일 수 있다.
막대그래프를 보면 HSP gene는 외부에서 스트레스를 받았을 때 많은 발현을 하는 것을 알 수 있으며, 스트레스를 받은 시간이 늘어날수록(많은 양의 스트레스를 받을수록) 더 많은 발현을 한 것을 알 수 있다.
RT-PCR step
1. RNA extraction
: 액체질소를 이용하여 식물을 갈아서 kit으로 mRNA 뽑아냄
2. Reverse Transcription (cDNA 합성)
: mRNA 상태는 불안정하기 때문에 정량이 어렵다.
3. Control PCR
: PCR결과로만 무조건 mRNA의 많고 적음을 얘기 할 수 없다. 따라서 표준이 되는 기준이 필요한데 이로써 같은 양의 cDNA를 만들어준다.
4. 목적 mRNA PCR
Plateau 효과
PCR로 원하고자 하는 부위를 늘어나다가 보면 무한대로 증가하는 것이 아니라 기질이나 primer가 모자라는 등 여러 가지 이유로 더 이상 증폭하지 않는 상태가 온다.
Housekeeping gene
세포가 살아가는데 항상 필수적으로 필요하며 같은 양이 지속적으로 발현되는 유전자이다. cotrol PCR에 사용되는데 우리 실험에서는 베타-Actin 유전자가 사용되었다.
6. Reference
분자생물학(2판). Robert F.Weaver 저. 박상대 역. 라이프사이언스 2003
http://www.bioneer.co.kr/
실험날짜
학 번
이 름
담당교수님

키워드

reverse,   기초유전학실험,   polymerase chain reaction