[분자유전학실험]4.Protein extraction and Quantitative analysis

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5. Discussion
6. Reference

본문내용

면역침전법, SDS page 등의 추가적인 실험이 필요하다고 본다.
모든 종류의 단백질의 농도를 결정할 수 있는 완벽한 방법은 지금까지 알려져 있지 않다. 이번 실험에 사용된 정량법 말고도 여러 가지 정량법이 있는데 따라서 단백질의 양을 정량하기 위해서는 단백질의 본질, 단백질 시료에 있는 다른 성분들의 본질, 정량분석의 신속도, 및 정밀도 등에 따라서 적당한 방법을 선택하여야 한다.
다른 방법으로 첫 번째로 뷰렛시험 (biuret test)이 있다. 두 개 이상의 펩티드 결합을 가지고 있는 화합물들은 알칼리성 용액에서 묽은 황산구리로 처리하면 자주색을 띠는 물질을 생성한다. 색깔은 구리원자와 두 개의 펩티드 사슬에서 오는 네 개의 질소원자들 사이에서 배위화합물이 형성됨으로써 생기는 것으로 생각되고 있다. 뷰렛 시험은 모든 단백질에 대해서 재현성이 꽤 좋으나 비교적 많은 양(1내지 20mg)의 단백질을 정량하는데 쓰이는 방법이다.
두 번째로 Lowry 시험(Folin-Ciocalteau)이 있다. Lowry등이 고안한 이 단백질 정량분석법은 용액에 있는 단백질뿐 아니라 건조된 시료에도 이용될 수 있다. 특히 이 정량방법은 5μg/ml정도의 단백질 양을 정량할 수 있는 대단히 민감한 방법이어서 널리 쓰이고 있다. 이 Lowry 방법에서 사용하는 Folin-Ciocalteau시약에 의한 발색은 뷰렛 시험에서와 마찬가지로 단백질과 알칼리성 구리와의 반응과 포스포몰리브덴산-포스포텅스텐산 염들이 단백질에 있는 티로신과 트립토판들에 의한 환원반응으로 생긴다. 이 두 아미노산의 함량은 단백질의 종류에 따라서 상당히 다르므로 1mg의 단백질에 대한 색의 세기가 일정하지가 않다. 표준곡선을 결정하는 데 사용한 단백질이 나타내는 색의 세기와 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 단백질을 정제하는 과정에 있어서 단백질의 함량변화를 측정하는 데는 매우 유용한 방법이다.
세 번째로 Kjeldahl법이 있다. Kjeldahl법은 단백질(또는 식품, 질소를 포함하는 다른 유기물)의 총 질소량을 정량하는 데 널리 이용되는 방법이다. 단백질을 촉매(예: CuSo₄,SeO₂,HgO)의 존재 하에서 진한 황산과 함께 오래 끓이면 그 질소는 모두 (NH4)2SO₄로 된다. 이 혼합물의 일정량에 과량의 NaOH를 넣고 증류하여 이 때 발생되는 암모니아를 H₃BO₃용액에 흡수시킨 후 표준 산 용액으로 적정하여 암모니아의 양, 나아가서는 질소의 양을 측정하는 방법. 미량 확산분석 방법. 직접비색 또는 NaOBr로 산화시킨 후 iodometry로 질소를 정량하는 방법이 있다. 단백질은 평균하여 16%의 질소를 가지고 있다. 즉 1mg N ≡ 100/16 ≡ 6.25mg의 단백질 에 해당된다. 따라서 Kjeldahl법으로 측정한 질소의 값에 6.25를 곱하면 곧 단백질의 함량을 알 수 있다.
마지막으로 네 번째는 UV법이다. UV법은 단순히 단백질 용액의 흡광도를 분광 광도계로 측정하는 방법이다. 단백질에는 주로 tyrosine 및 tryptophan의 측쇄로부터 유래된 280nm 부근의 흡수가 있으나 buffer에는 이 부분의 흡수를 가지는 것이 적기 때문에 이것을 측정한다. 측정법위는 0.1~1mg/ml 정도로서 간단하게 sample의 회수가 가능하다. 하지만 흡수는 tyrosine, tyrptophane의 비율과 입체구조에 의존하기 때문에 광학계수는 단백질에 따라 다르다. 따라서 흡광계수가 미리 알려져 있는 단백질의 농도를 결정할 경우, 먼저 chromatography를 행한 뒤, 어느 부근에 어느 정도의 단백질이 용출되는가를 대략적으로 조사할 경우에 적합하다. Column의 끝에 flow cell식의 흡광도계(UV모니터)를 붙이고 연속적으로 단백질의 용출 패턴을 monitor하는 것이 가능하다.
6. Reference
미생물학 12판 (Brock biology of microorganisms) / Madigan 저 오계헌 역 / 바이오사이언스 / 2009.04.15 / p440
http://mybox.happycampus.com/nike0/371470
http://whitemagnolia.springnote.com/pages/3526445
http://blog.naver.com/ckurapika0?Redirect=Log&logNo=10048124339
http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin
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담당 교수님

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