Alkaline lysis 방법에 의한 plasmid DNA의 분리(Chromosomal DNA 비교)!!

소개글

Alkaline lysis 방법에 의한 plasmid DNA의 분리(Chromosomal DNA 비교)!!에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.서론
우리는 이번 실험에서 JM109와 BL21에 존재하는 Ampcillin 내성 plasmid인 PGEX4T3 DNA를 Alkaline lysis 방법으로 분리해 냄으로 plasmid분리방법을 습득하고, 분리한 plasmid DNA의 순도를 앞에서 실험한 chromosomal DNA와 마찬가지로 분광광도계를 이용하여 정성/정량분석 하겠다.
앞에서 실험한 chromosomal DNA분리 방법과의 차이를 알아보고, plasmid DNA분리 방법에는 어떠한 것이 있는가를 알아본다.
plasmid DNA분리는 주로 miniprep이라고 부르는 방법으로 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다.
플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다.
플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면 된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다.
그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다.
플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다.
기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다.
이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다.
이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다.
다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다.

bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법은 대단히 많지만 성공률과 속도를 생각하여 세가지 방법으로 소개하면 Alkaline lysis prep, boiling method ,lithium-based procedure 이다.
① Alkaline lysis miniprep
alkaline lysis procedure은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다.
Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될 수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다. 여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다. 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다.
chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.
② Boiling miniprep
Plasmid를 지닌 bacteria는 lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리 등으로 깨어질 수 있다.
chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을수 있으며 plasmid DNA는 상등액에서 isopropanol로 침전시켜 분리할 수 있다.
boiling miniprep는 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법

본문내용

을 new microcentrifuge tube로 옮김(300μl)
-하층액이 딸려 올라오는 것을 방지 하기 위해서 200μl옮긴후 100μl옮김
⑫상층액과 동일한 양의 Phenol/chloroform을 첨가(300μl)
⑬15초간 vortex
⑭centrifuge 12,000 rpm 2min 원심분리
⑮상층액(aqueous phase)을 new e-tube로 옮김(300μl)
-하층액이 딸려 올라오는 것을 방지 하기 위해서 200μl옮긴 후 100μl옮김
Plasmid DNA의 회수방법
①2 vol의 ethanol을 첨가
②vortex
③실온에서 2min 방치
④4℃에서 centrifuge 12,000 rpm 5min 원심분리하여 핵산을 침전시킴
⑤상층액을 조심스럽게 제거
⑥tube를 paper towel에 거꾸로 세워서 2min 방치
⑦70% ethanol 1ml을 tube에 첨가
⑧수차례 inverting하여 조심스럽게 혼합
⑨4℃에서 centrifuge 12,000 rpm 5min 원심분리하여 핵산을 침전시킴
⑩실온에서 ethanol을 조심스럽게 제거
⑪tube를 paper towel에 거꾸로 세워 잔여 ethanol완전 제게(5-10min)
⑫20 μg/ml DNase-free RNase A (pancreatic RNase)를 함유한 50 μl의 TE (pH8.0) buffer 를 tube에 넣어 DNA를 녹임
Plasmid DNA의 분석
①10 μl의 DNA 용액을 990 μl의 TE buffer에 희석
②분광광도계를 이용하여 분리된 plasmid DNA의 정성/정량분석(260nm/280nm)

키워드

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