대장균의 형질전환, Plasmid DNA 분리와 전기영동 레포트

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목차

대장균의 형질전환, Plasmid DNA 분리와 전기영동
Ⅰ. 서론
Ⅱ.재료 및 방법
Ⅲ.결과
Ⅳ. 논의
Ⅴ.참고 문헌

본문내용

DNA는 맨 눈으로 관찰이 어려운 시료이기 때문에, 실험 과정에서는 DNA의 시각적 확인을 위해서 특수한 염색 방법을 사용한다. 일반적으로 실험실에서는 Ethidium bromide(EtBr)라는 화학물질을 사용하는데, EtBr은 DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조를 가진 그룹을 지니고 있어서 이 그룹이 DNA 염기에 결합하면 유리된 상태의 EtBr와 달리 자외선에서 형광을 나타낸다. 이렇게 EtBr에 염색된 DNA가 내는 형광 가시광선을 통해 우리는 DNA를 시각적으로 확인하고 분석할 수 있다. 하지만 EtBr은 강력한 발암물질이고 독성을 지닌다. 따라서 학생들을 대상으로 한 실험에서는 EtBr 대신 핵산을 염색할 수 있는 메틸렌블루를 사용한다.(박선우, ecodye. 2014).
Ⅱ.재료 및 방법
1.실험 재료
1) 대장균의 형질전환
LB 액체 배지, 고체 LB plate 배지, PGEM T-Easy plasmid vector- Yes, Amp resistance, pDR274 plasmid vector-NO, Amp resistance, JCompetent cells, Ice,Water bath, Floating rack,Micropipette, Yellowtip, 알코올램프, spreader, Inoculation loop
2) Plasmid DNA 분리
Escherichia coli in LB medium(3ml), Plasmid mini-prep kits, D.W., Microcentrifuge, Vortex, Micropipette, tube,「Spin column, Cell resuspension solution(SolI), Cell lysis solution(SolII), neutralization solution(solIII), wash buffer(solIV), Elution buffer
3) 전기영동
plsmid DNA, Agarose, 0.5X buffer, 6X Loading dye, Elution buffer, EtBr(Ethidium bromide, Size marker, Electrophoresis, Gel cast, Tray, Comb, Micropipette, Polyglove, Microwave oven, UV transilluminator
2.실험 방법
1) 대장균의 형질전환
①-70℃ 냉동고에서 Competent cell을 꺼내어 얼음 위에서 천천히 녹인다튜브 ② 새 Tube에 녹은 com. Cell 10ul을 넣은 후, Plasmid DNA를 2ul 넣고 20분간 Ice에 꽂아 둔다
③42℃에서 30초 열충격을 준다.
④Ice에 다시 2분간 꽂아둔다.
⑤LB액체 배지 200ul 첨가 후 Incubation 37℃ 40분에 둔다
⑥고체배지에 200ul를 도말한다.
⑦37℃에서 16시간 이상 배양한다. (뒤집어서)
⑧ 다음날 콜로니의 사진을 찍는다.
2) Plamid DNA 분리
①대장균이 배양된 배지 1ml를 microtube에 옮기고 13,000rpm에서 1분간원심분리 한다.
②Pellet을 제외한 상등액을 제거한다.
③①~②를 한번 더 반복한다.
④원심분리를 통해 벽에 남아있던 잔여 배지 성분들을 모아 제거한다.
⑤Soll 250ul 넣고, vortex로 cell을 잘 풀어준다.
⑥SolI 250ul 넣고, 5회 inverting 한다.
⑦SolⅢ 350ul 넣고, 5회 inverting 한다.
⑧13,000rpm에서 10분간 원심분리 한다.
⑨상등액 850ul spin column에 옮긴다.
(침전물이 빨려 오지 않도록 주의해야 한다.)
⑩13,000rpm에서 1분간 원심분리 한다.
⑪Column에 걸러진 용액을 제거한다.
⑫Wash buffer 700ul를 넣는다.
⑬2분 후, 13,00rpm에서 1분간 원심분리 한다.
⑭Column에 걸러진 용액을 제거한다.
⑮13,000rpmn에 1분간 원심분리를 한다.
Column을 microtube에 옮긴다.
Column에 elution buffer 50ul를 넣는다.
1분 후, 13,000rpm에서 1분간 원심분리 한다.
Column을 제거한다.
정제한 plasmid DNA는 20℃에서 보관한다.
3) 전기영동
①Well의 왼편에 size maker를 5ul 넣고 다음 well부터 차례로 loadingdye와 섞은 DNA를 넣는다. (20ul loading)
②전기영동장치의 플러그를 전력공급장치에 연결한 후, 전기를 걸어 20~30분간 전기영동을 한다.
③전원을 끄고, 플러그를 제거한 후 겔을 조심스럽게 꺼내 UV를 통해 plasmid DNA의 존재와 크기를 알아본다.
Ⅲ.결과
1) 대장균의 형질전환
<그림1. 형질전환 하지 않은 대조군> <그림2.형질전환을 진행한 실험군>
형질전환을 진행한 실험군 배지에 대장균이 배양되었고, 형질전환을 하지 않은 대조군 배지에는 대장균이 배양되지 않았다.
<그림3.형질전환된 액체 배지 대쟝균 배양 결과>
형질전환된 액체 배지에 대장균을 배양한 결과 대 장균이 배양되지 않았다.
2) Plasmid DNA 분리와 전기영동
<그림4. 전기영동 결과>
전기영동 결과 4kb DNA가 검출되었다.
Ⅳ. 논의
플라스미드 DNA는 박테리아와 일부 균에 존재하는 염색체 이외의 DNA 로 ‘작고 스스로 복제하는 두 가닥의 환형의 DNA’라 정의할 수 있다. 플라스미드를 통해서 형질전환을 한 결과 형질전환을 하 ㄴ고체 배지에는 대장균이 배양되었고, 형질전환을 하지 않은 고체 배지에는 대장균이 배양되지 않았다. 또한 형질전환을 한 액체 배지에는 대장균이 배양되지 않았는데 실험 당시 기간 관계 상 실험을 클린존이 아닌 곳에서 진행을 한 것이 큰 원이라고 생각된다. Plasmid DNA 분리와 전기영동을 실험한 결과 전기영동을 통해서 4kb DNA가 검출되었다.
Ⅴ.참고 문헌
·David L et al, 2014, (레인저) 생화학, 월드사이언스, pp317-318
·Algred E et al, 2008, 미생물학실험서, 지코사이언스, p401, p405
·박선우, 2014, Biology 2권, 피엠디아카데미, pp254-256

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대장균,   형질전환,   Plasmid DNA,   전기영동,   Plasmid DNA 분리