Western blot: 항체반응 및 시료검출

소개글

Western blot: 항체반응 및 시료검출에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Date
　
2. Subject
　
3. Object
　
4. Introduction
　① Overview of Immunoblotting (=western blotting)
　② Western blotting
　③ 항체와의 반응과 항원의 검출
　
5. Materials & Apparatus
　※ Tween 20
　※ BCIP/NBT
　
6. Methods
　※ 주의사항
　
7. Results
　
8. Discussion
　
9. Reference
　

본문내용

1. Date
12, 19 May 2006
2. Subject
Western blot: 항체반응 및 시료검출
3. Object
Western blot의 SDS-PAGE 및 membrane transfer 과정의 원리를 익힌다. 항체반응을 하기 위하여 용액들을 만들어 membrane에 넣고 blocking을 한 후, BCIP/NBT를 기질로 이용하여 검출한다.
4. Introduction
① Overview of Immunoblotting (=western blotting)
1) SDS-PAGE: size별로 분리
(꼬여 있는 것이 SDS와 heat로 인해 펴짐, charge density가 일정).
2) Transfer of membrane
그림 1. Protein transfer
3) Ponceau S staining: transfer buffer로 wash하면 없어짐
(destaining with transfer buffer)
4) Blocking: antibody가 붙는 것을 막기 위한 것임.
여러 가지 모인 protein: 5% skim milk(지방 뺀 분유), 깨끗한 protein: 5% BSA
그림 2. Blocking
5) Primary antibody
그림 3. Primary antibody
6) Washing ← Primary antibody를 TTBS로 wash
7) Secondary antibody: (가끔은 secondary antibody를 쓰지 않고 primary antibody
만으로 하는 경우도 있다).
그림 4. secondary antibody
8) Wash
② Western blotting
Western blotting은 SDS-PAGE를 행한 후, 단백질을 membrane에 전사하고, 항체를 이용한 특정의 단백질을 검출하는 방법이다. 목적의 단백질에 대한 항체를 가지고 있으면, 이 방법으로 검출하는 것이 가능하다.
항체에는, polyclonal 항체와 monoclonal 항체가 있다. Polyclonal 항체를 만들기 위해서는 토끼의 항원을 주사하여 면역시키고, 항체가 형성되었을 때 채혈하고 혈청(항혈청)을 검출한다. Western blotting에는 이것을 그대로 희석하여 이용하는 경우도 있고, 그리고 항원 column을 이용하여 특이적 항체를 정제하여 이용하는 경우도 있다. 어느 쪽이든 더욱 좋다고 말할 수 없지만, 항혈청으로서 깨끗하다면 정제할 필요는 없다.
Monoclonal 항체를 만들기에는 면역한 마우스로부터 항체 생산세포를 분리하여 배양하고, 그로부터 목적의 단백질에 대한 항체를 생산하는 세포를 선별하여 clone화하고 이것을 배양 중 또는 마우스의 복수 중에서 증식시킨 항체를 회수한다. 한 개의 clone은 한 종류의 항체밖에 만들지 못하기 때문에 다른 항체를 포함하지 않는 대신 특이성이 높은 것이 기대된다. 그리고 항체는 보통 항원의 비교적 작은 영역(10개의 아미노산 이하)을 인식하기 때문에 의외의 교차반응이 나타나고, 전혀 관계없는 단백질과 반응하는 경우도 있다.
항체는 종류에 따라 항체가나 특이성에 의한 큰 차이가 있기 때문에, 처음에 조건을 잘 검토하여야 한다.

키워드

Western blot,   항체반응,   시료검출,   단백질,   항원,   BCIP/NBT,   Tween 20