생화학) 단백질정제

소개글

생화학) 단백질정제에 대한 보고서 자료입니다.

목차

● 서 론
단백질의 정의
단백질의 구조

● 본 론
단백질의 정제
단백질의 정제 목적
단백질의 정제기술
단백질의 분리
단백질의 분리 정제 분류
단백질의 화학반응
- 크로마토그래피 ① 이온 교환 크래마토그래피
- 크로마토그래피 ② 겔 여과 크래마토그래피
- 크로마토그래피 ③ 친화 크래마토그래피
- 원심 분리
- 전기영동 ① SDS-PAGE
- 전기영동 ② Isoelectric focusing
- 염석과 투석

● 결론
참고문헌

본문내용

ix 복합체를 관에 채우고 시료를 통과시키면 ligand에 선택적으로 결합할 수 있는 물질은 남아 있고 친화력이 없는 물질은 모두 용출된다.
Ligand에 결합되어 있는 물질을 ligand로부터 용출하기 위해서는 용출액의 pH 또는 이온 강도를 변화시키거나 ligand에 친화력이 강한 물질을 용출액에 첨가해 주면 용출된다. ligand로 glucose가 결합되어 있는 지지체를 이용하여 식물성 단백질인 concanavalin A를 분리하는 경우, Concanavalin A가 들어 있는 시료를 관에 통과시키면 glucose와 선택적으로 결합하는 concanavalin A는 관에 남아 있고 나머지 단백질들은 그대로 통과 된다.
관에 남아 있는 concanavalin A는 용출액에 glucose를 첨가하여 주면 유리되어 순수하게 분리할 수 있다. 이 경우 정제 배수를 다른 정제법보다 월등히 높일 수 있다.친화크로마토그래피는 친화성이 있는 물질들을 정제하는데 다양하게 이용될 수 있으나, 친화성이 있는 물질들의 짝만을 정제하는데 이용할 수 있다는 단점도 가지고 있다.
2. 원심 분리
원심 분리법은 용도에 따라 고속원심기와 초고속원심기등을 사용할 수 있다. 다음은 세포를 분세한 후 세포내의 소기관들을 분리하는 과정에 관하여 설명한 것이다. 위 방법으로 정제하고자 하는 단백질들이 어떤 fraction에 위치하는지 확인한 후 그 fraction을 이용하여 분리 정제에 이용하면 된다.
3. 전기영동
① SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
SDS-PAGE는 단백질을 분자량에 따라 분리하는 방법으로 단백질을 SDS로 처리하면 비공유결합이 전부 파괴되어 변성될 뿐만 아니라 소합체성 단백질인 경우에는 각각의 단위체로 분리되기 때문에 SDS-polyacrylamide 겔 전기영동은 단백질의 분자량 뿐만 아니라 단위체의 유무를 결정하는 데 매우 유용하다. 단위체가 disufide 결합으로 연결되어 있는 경우에는 전기 영동을 시행하기 전에 mercaptoethanol등으로 처리하여 disulfide 결합을 끊어 주어야 한다. SDS가 단백질과 결합하여 SDS-단백질 복합체를 형성하면 SDS의 sulfate기 때문에 단백질 자체의 전하는 거의 무시되고 강한 음전하를 띠게 된다. 대부분의 단백질은 SDS와 거의 일정 비율(단백질 1g 당 SDS 1.4g)로 결합하므로 단백질의 질량에 대한 전하비가 일정하여 전장에서의 이동속도는 단백질 분자의 크기에 좌우된다. 단백질이 이동한 거리는 단백질 분자량의 대수와 역 상관 관계에 있으므로 이동거리로부터 분자량을 알아낼 수 있다.
② Isoelectric focusing
Isoelectric focusing은 단백질을 등전점(pI)의 차이에 따라 분리하는 방법으로 지금까지 개발된 전기영동법 중에서 해상력이 가장 뛰어나 단백질 시료를 정밀하게 분석하는 데 많이 사용된다. 이 방법은 단백질이 이동해 갈 때 겔의 음극쪽으로 갈수록 pH가 증가하도록 pH 차이를 만들어 단백질들이 각자의 등전점과 다른 pH 겔 상에 있을 때는 전하를 띠게 되므로 양 또는 음극으로 이동하다가 각자의 등전점의 위치에 이르게 되면 전하를 띠지 않게 되므로 그 자리에 멈추게 되어 단백질마다 하나의 띠를 형성하는 focusing 현상이 일어난다.
이론적으로 pH 차이는 양극쪽에 산을 가하고 전류를 통하면 H+이 음극쪽으로 이동해 가므로 pH 차이가 형성되나 이때 형성된 pH 차이는 불안정하여 단백질 분리에 사용할 수 없기 때문에 pH 차이를 안정화시키기 위하여 ampholyte를 겔에 첨가한다. Ampholyte 시약에는 등전점이 서로 다른 여러 종류의 물질들이 섞여 있기 때문에 전장에서 이들은 등전점의 차이에 따라 낮은 등전점을 갖는 것은 양극쪽으로, 높은 등전점을 갖는 것은 음극쪽으로 배열하여 안정된 pH 경사를 형성한다.
4. 염석과 투석
단백질이 물에 녹아있다는 것은 단백질 분자 주변에 물 분자가 결합하여 단백질들과의 결합을 방해하는 상태를 말한다. 어느 정도 농도의 단백질들이 물에 녹아 있을 경우 salt를 첨가하면 단백질들의 용해도는 변하게 된다. 그 이유는 단백질 분자 주위의 물 분자가 첨가된 salt와 친화도가 높아 salt와 결합을 하기 때문이다. 그로인해 단백질 분자들은 서로 서로 충돌할 가능성이 높아지고 단백질간의 소수성 결합 등 결합을 할 수 있는 기회가 증가하여 일반적으로 소수성 단백질일수록, 단백질의 분자가 클수록 먼저 침전하게 된다.
실험에 적용은 우선 조직 균질액에 salt를 5% 혹은 10%씩 첨가하여 여러 농도별 침전물을 얻은 후 어떤 농도에서 정제하고자 하는 단백질이 침전하는 지를 확인한다. 그 후 침전이 생기지 않았던 농도까지 salt를 첨가하여 원침한 후 침전물을 제거한 후 상층액에 정제하고자 하는 단백질이 침전하는 농도로 salt를 추가하여 침전물을 수집하면 단백질의 정제와 농축 효과를 동시에 얻을 수 있게 된다. Salt를 첨가 할 때 너무 빨리 첨가하게 되면 어떤 단백질들은 변성이 될 수 있기 때문에 salt를 낮은 온도에서 천천히 첨가하는 것이 좋다. 단백질 정제에 salt를 이용하는 것과 같이 온도나 pH 그리고 polyethylene glycol, 유기용매 등을 단백질 정제와 농축에 이용할 수 있다.
염석으로 단백질을 분리 농축한 후에는 다시 단백질을 용해시켜야 하며, 이를 위해 투석을 이용한다. 그 원리는 투석막에 분자량이 작은(선택가능, 5,000 - 50,000 kDa) 분자는 막투과가 용이하나 거대분자들은 이동이 불가능한 상태여서 막 외부에 salt 농도가 낮은 완층액을 첨가여 salt의 확산을 유도하면 단백질은 막내에 있고 분자량이 작은 salt만을 제거할 수 있다.
결론
참고문헌
http://cafe.naver.com/solgent.cafe?iframe_url=/ArticleRead.nhn%3Farticleid=36
http://blog.naver.com/lovehrh?Redirect=Log&logNo=30020108297
생화학 길라잡이

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생화학,   단백질정제,   단백질분리,   크로마토그래피,   원심분리,   전기영동,   염석,   투석