세포생물학-Electrophoresis of DNA-1

목차

1.Introduction

*Reference

2. Material
3. Method
4. Result
5. Discussion

*Reference

본문내용

tic acid 서로 pH buffer 로 급격한 pH변화를 막는 완충제 역할을 한다. 또, 버퍼안의 EDTA는 금속킬레이트제로서 마스네슘 이온인 2가 양이온이랑 결합하여 효소의 활성을 억제 시키는 역할, 염을 생성해서 세포벽을 무너뜨리는 작용을 하여 세포벽 안쪽에 있는 DNA를 쉽게 볼 수 있도록 도와준다. 이번 실험에서는 method 8번의 plasmid DNA와의 비교는 없었다. 이번 실험에서 중요한 점은 gel에서 DNA의 전개에 미치는 영향이다. 위에서 설명한 것들을 비롯하여 정리하면 다음과 같다. ① gel안의 농도에 의한 DNA입자의 전개(DNA입자가 gel의 입자를 피해서 내려옴) ② 전하차이(전기영동하는 과정에서의 전하량의 차이) ③ DNA량(DNA의 농도의 차이) ④ EtBr의 양(DNA와의 친화력 차이). 이와 같은 것들에 의해 DNA의 전기영동의 결과 값이 차이가 있을 수 있다.
(추가-차이요인설명)
agarose는 완전히 순수 분리된 것은 아니며 다른 다당류나, 염, 단백질 등이 혼합되어있으며, 이런 물질들이 포함된 정도에 따라 전기영동시 DNA가 이동되는 정도나 DNA가 gel에서 분리되는 정도가 달라진다. 따라서 효소 억제제와 nuclease가 함유되어 있지 않으며 ethidium bromide로 염색할 경우 형광의 배경을 극소로 하기 위한 특별히 정제된 agarose를 사용해야한다. 전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문이다. 아래의 표는 agarose농도에 따른 분리되어지는 DNA조각 크기이다. 이러한 표를 보고 원하고자 하는 DNA에 맞는 아가로즈 겔을 사용하여야 한다.
다음은 Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들이다.
1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그 다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.
4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.
6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.
7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.
여러 DNA 형태를 알아내기 위한 확실한 방법은 ethidium bromide의 양을 증가시켜 전기영동을 시행하는 것이다. Ethidium bromide(EtBr)은 DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조를 가진 그룹을 지니고 있어서 이 그룹이 DNA 염기에 결합하면 유리형의 ethidium bromide보다 형광이 증가된다. Ethidium bromide의 농도가 증가하면 더 많은 ethidium bromide가 DNA와 결합하게 된다. Supercoiled DNA에서 negative superhelical turn은 차차 제거되고 반지름이 증가하게 되어 이동속도는 느려지게 된다. Superhelical turn이 남아있지 않은 적절한 색소의 농도에서 이동속도는 가장 느리다. 여기에 더 많은 ethidium bromide가 첨가되면 positive superhelical turn이 생기게 되고 DNA 분자는 더 치밀해지며 이동속도는 급속도로 빨라진다. Linear와 open circular DNA의 이동은 DNA가 중성의 전하를 띠거나 ethidium bromide에 의해 굳어지는 경우에 이동속도가 느려진다. 낮은 전압에서 선형으로 된 DNA 조각의 이동속도는 부하되는 전압에 비례한다. 그러나, 전기장에서 전류의 흐름이 커짐에 따라 높은 분자량을 가진 DNA 조각의 이동속도는 빨라지게 되므로 전압이 올라감에 따라 agarose gel에서 DNA 분리 효과가 감소된다. 2 kb보다 큰 DNA 조각들의 분리를 최대로 하기 위해서는 agarose gel에 5 V/cm 이상의 전압을 부하시켜서는 안 된다.
*Reference
1. 유전자감식/DNA프로필연구회/탐구당/2001/p28~30
2. 유전자클로닝입문 제 4판/강종백 외3인/ 월드사이언스/ 2003/ p72~73
3. 유전자 진단의 이론과 실체/김영설/한의학/1998/p41~47
4. 전기영동 최신 프로토콜/ 강호일/ 월드사이언스/ 2006/p14~21

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