세포생물학-Polymerase chain reaction(PCR).

목차

1.Introduction

(1). PCR의 개요

(2). PCR의 원리

(3). DNA 증폭장치

(4). 중합효소 연쇄 반응에 영향을 주는 여러 가지 요인들

(5). 중합효소 연쇄 반응법의 응용

(6). 적정 온도의 결정

*Reference

세포생물학 실험Ⅱ

2. Material

3. Method

4. Result

5. Discussion

*Reference

본문내용

aq polymerase는 그 기능은 유지한다. 그리하여 PCR시 Taq polymerase를 사용한다.
우리는 35번의 cycles을 돌려 얻고자 하는 DNA를 증폭시켰다. 각 Cycle이 돌아지면서 각 과정마다 원하는 온도가 있다. 95℃에서는 주형 DNA를 변성시켜 이중나선을 풀어준다. 그래야 프라이머가 그 주형 DNA 사이를 비집고 들어가 복제할 수 있기 때문이다. 그리고 60℃가 되면, 프라이머가 복제할 DNA에 붙을 수 있게 된다. 각각의 프라이머가 DNA에 붙은 후 72℃가 되면, 뉴클레오티드가 주형 DNA와 상보하여 하나씩 하나씩 붙게 되어 신장이 일어난다. 신장이 계속 되어 주형 DNA의 마지막 뉴클레오티드와 상보결합이 되면 한번의 Cycle이 끝난 것이다. 이러한 cycle이 35번을 돌리면, 35번의 복제가 일어나기에 처음보다 만큼의 DNA를 얻을 수 있게 된다. 그러나 실제로는 이보다 효율이 적다. 효율이 저하되는 이유는 ①DNA polymerase의 활성의 감소 및 증폭단편(주형DNA)의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족②증폭단편간 annealing이 primer의 annealing과 competition등이 있다. 일반적으로는 25~35cycles의 반응이 이루어지지만 증폭산물이 증가되면 그 자신이 primer가 되어 2차적인 반응이 일어나기 쉽고 비특이적인 DNA의 증폭을 일으키게 된다. 그러므로 불필요하게 cycle수를 증가하지는 말아야한다.
이것을 확인 하기 위해 1% agarose gel에서 전기영동을 돌린다. 그 결과가 위의 result와 같이 나왔다. 우리 2조는 2번과 3번밴드가 확실히 확인이 되었다. 과거에는 직접 수작업으로 PCR을 하여 정확하지 않을뿐더러 오염성이 많았다. 그러나 지금은 PCR machine이 있어 좀더 쉽게 PCR을 할수 있다. 이러한 PCR은 크게 3단계로 나뉜다.
1) Denaturation : 두가닥의 DNA를 95℃정도에서 15-30초간 처리하여 각각의 한가닥 DNA로 해리시킨다.
2) Annealing : 열처리로 변성된 한 가닥 DNA에 primer가 상보적인 위치에 annealing하게 된다. Annealing 온도와 시간은 primer의 염기배열과 길이에 따라 결정된다. 통상의 경우 45℃-60℃사이에서 이루어진다.
3) Elonggation(Extension) : 한가닥 DNA에 primer가 상보적으로 결합한 상태에서 보통은 Taq polymerase를 이용하여 신장시킨다. Extension 시간은 증폭하고자 하는 주형 DNA크기에 비례하여 조정한다. Taq polymerase에 의한 DNA 합성속도는 약 60 nucleotides/sec(70℃)이다.
*Reference
최신 유전학/ D. Peter Snustad/ 김상구외 4/ 법한서적주식회사
필수세포생물학/ Bruce Alberts외 6/ 박상대외/ 교보문고/ 1999
네이버/ http://blog.naver.com/nango0o?Redirect=Log&logNo=140072058193

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