Lowry protein assay (단백질 정량 분석) 실험_예비레포트 [A+]

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목차

1. 실험 목적
2. 바탕 이론
3. 실험 기기 및 시약
4. 실험 방법
5. 참고문헌

본문내용

조절해주는 역할을 한다.
③ Copper tartrate hydrate : 구리이온은 단백질의 펩타이드 결합 간에 복합체를 형성해서 로 환원시키는 Biuret 반응을 하게 한다.
⑵ Folin & Ciocalteu‘s Phenol reagent
④ Sodium tungstate dihydrate ()
⑤ Sodium molybdate dihydrate ()
⑥ Lithium sulfate monohydrate () 염산,인산의 complex 이다.
단백질과 Lowry reagent와 뷰렛 반응이 일어난 후에 Cu+ 와 아미노산의 radical으로 인해 환원된 후 푸른색을 띤다.
(3) 증류수
(4) UV/Vis spectrophotometer
Fig 6. UV/Vis spectrophotometer
(5) 큐벳
Fig 7. cuvette
(6) BSA (Bovine Serum Albumine)
4. 실험 방법
<시약제조>
Lowry Reagent : Lowry reagent가 들어있는 시약병에 40ml의 증류수를 넣고, 거품이 최대한 생기지 않도록 pipetting하여 잘 녹여준 다음 상온에 보관한다.
Folin&Ciocalteu’s Phenol reagent : Folin&Ciocalteu’s Phenol reagent 18 ml을 KIT에 포함된 갈색 병에 옮긴 후, 증류수 10 ml로 Folin&Ciocalteu’s Phenol 시약이 들어있던 병을 헹궈주어 안에 남아 있는 미량의 시약까지 다 옮겨준다. 그 후 증류수 80ml을 넣어 잘 섞어준 뒤 냉장 보관한다.
Protein standard(400 μg/ml) : Protein standard병에 증류수를 5 ml 넣어 잘 섞어준 뒤 냉장보관한다.
* 단백질 용액에 Lowry Reagent을 넣고 20분간 반응시킨 후, Folin&Ciocalteu’s Phenol reagent를 넣어 30분 동안 반응시킨다. 그리고 UV/Vis spectrophotometer를 이용해서 이 용액에서 가장 높은 흡광도를 보이는 파장을 찾는다.
1. BSA 원액(2mg/ml)을 증류수로 희석하여 0, 50, 100, 150, 200 μg/ml의 BSA 샘플을 제조 한다.
2. 각 농도의 BSA 용액 200 μl에 미리 제조해 둔 Lowry reagent를 1ml씩 넣고 pipetting 해 준다.
3. 20분간 상온에서 반응시킨 후, Folin & Ciocalteu’s Phenol reagent를 100 μl 씩 넣는 즉시 빠르게 pipetting하여 섞어준다.
4. 약 30분간 색 변화를 육안으로 관찰한다.
5. 최적의 파장대를 설정하기 위해 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 nm의 파장대에서 각 샘플의 흡광도를 측정한다.
6. 최적의 파장대를 설정한 후, BSA standard curve를 도출한다. (각 단백질 샘플의 흡광도를 3회 이상 측정 후, BSA curve에 error bar까지 나타낼 것)
미지의 단백질 농도 측정
1. 미지 농도의 단백질 용액을 여러 개 준비한다.
2. 증류수를 이용하여 위 실험에서 설정된 파장대로 UV/Vis spectrophotometer의 Auto-zero 를 설정한다.
3. 대조군 및 미지의 단백질 용액 200 μl에 미리 제조해 둔 Lowry Reagent를 1ml씩 넣고 pipetting 하여 섞어준다.
4. 20분간 상온에서 반응시킨 후, Folin & Ciocalteu’s Phenol reagent를 100 μl씩 넣는 즉시 빠르게 pipetting하여 섞어준다.
5. 약 30분간 색 변화를 육안으로 관찰한다.
6. 대조군 및 각 단백질 용액을 UV/Vis spectrophotometer를 통해 위에서 설정한 파장대에 서 흡광도를 측정한다.
7. 주어진 BSA standard curve를 이용하여 각 미지 단백질 용액의 농도를 구한다.
5. 참고문헌
[1] Ninfa, Alexander J. (2010).Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. Wiley. page.117118
[2] 2018년도 2학년 2학기 실험노트
[3] MSDS
[4] William L. Masterton Cecile N. Hurley Edward J.Neth, 화학교재연구회, 2014, 마스터톤의 일반화학, 사이플러스, page 347~361

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