Plasmid DNA isolation from bacterial cell_Miniprep_결과레포트 [A+]

소개글

Plasmid DNA isolation from bacterial cell_Miniprep_결과레포트 [A+]에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Abstract
2. Experiment
3. Result
4. Discussion
5. Reference

본문내용

l를 loading한다.
(15) Loading star (6X) 2 μl를 새로운 micro tube에 넣고 10 μl Plasmid DNA 추출 용액과 섞은 뒤 두 번째 홈에 loading한다.
(16) 100 V의 전압에서 1시간동안 전기영동을 진행한다.
(17) Agarose gel을 꺼내 UV transilluminator위에 놓고 자외선을 쬐어 Plasmid DNA의 크기를 확인 한다.
※ 실험 시 유의사항
- 원심분리시킬 때 micro tube 끼리의 무게가 대칭이 되게 해야 한다.
- S1 Buffer는 중성 pH에 가깝기 때문에 사용하는 중에 오염될 위험이 있다. 따라서 저온에 보관해야 장기간 사용할 수 있기 때문에 냉장보관해야 한다.
- S2 Buffer를 넣고 inverting 한 뒤 반응시간이 5분을 넘지 않도록 해야 한다. 왜냐하면 S2 단계는 DNA 변성 단계이기 때문에 5분 이상 방치하면 용해가 더 진행되어 과도하게 변성되고, 원상복귀가 불가능해 우리가 원하는 plasmid DNA를 얻을 수 없게 될 수 있기 때문이다.
3. Result
이번 실험에서 Plasmid DNA를 추출하기 위해 사용한 미생물은 대장균 (E.coli)이다. 실험을 진행한 뒤 추출한 Plasmid DNA의 크기를 측정하기 위해 겔 전기 영동법을 진행하였다. 그 결과 다음 Fig 17.에서와 같이 첫 번째 홈에 loading한 DNA ladder (기준이 되는 샘플)와 우리 6조의 결과를 비교했을 때 약 4.0kbp의 크기를 가지는 plasmid DNA가 얻어진 것을 확인할 수 있었다.
Fig 17. DNA ladder와 전기영동 실험 결과
4. Discussion
이번 실험에서 추출한 plasmid DNA의 실제 크기는 8kbp 인데, 전기영동의 결과 plasmid DNA의 크기는 4.0kbp가 나왔기 때문에 상당한 차이가 있다. 이러한 오차가 발생한 원인은 다음과 같이 정리할 수 있다.
(1) Plasmid DNA의 형태
- Plasmid DNA를 분리하였을 때 나타나는 형태는 다양하게 나타난다. 이는 다음과 같이 크게 3가지의 형태로 분류할 수 있다.
① Nicked open-circular plasmid DNA (열린 원형)
- 원형의 이중가닥 plasmid DNA 중 한쪽 가닥이 끊겨 있는 상태이다.
② Supercoiled plasmid DNA (닫힌 원형 또는 초나선)
- 이중가닥 plasmid DNA가 끊기지 않고 초나선으로 꼬여져 뭉쳐있는 상태이고, 미생물로부터 분리된 plasmid DNA는 대부분 전기영동 후 Agarose gel 상에서 이 형태로 존재한다.
③ Linear plasmid DNA (선형)
- 이중가닥 plasmid DNA가 양 쪽 모두 끊어져 두 가닥이 모두 선형으로 존재하는 상태이다.
Fig 18. Plasmid DNA의 다양한 형태
일반적으로 전기영동 실험 결과로 얻을 수 있는 Plasmid DNA의 형태는 닫힌 원형의 Supercoiled plasmid DNA 이지만, 이번 실험에 사용한 DNA ladder의 형태는 선형이다. 전기영동 시 같은 분자량의 DNA나 같은 길이의 DNA라도 DNA의 형태(구조)에 따라 이동속도가 달라진다. 왜냐하면 선형의 DNA보다 응축된 원형 DNA가 Agarose gel의 격자구조 사이를 지나가는데 저항을 적게 받아 더 빠르게 통과하기 때문이다. 따라서 이번 실험에서 측정한 실험 결과는 Supercoiled plasmid DNA의 크기이기 때문에 원래 선형 DNA보다 더 작게 측정된 것이며, 원래 크기의 1/2 정도의 영역에서 결과가 나타나게 된다. 따라서 실제 plasmid DNA의 크기는 전기영동 결과에서 관찰된 4.0kbp의 두 배인 8.0 kbp라고 할 수 있다.
Fig 19. Plasmid DNA의 형태에 따른 이동거리 차이
(supercoiled DNA > linear DNA> open circular DNA)
추가적으로 전기영동 실험 결과인 Fig 17.을 살펴보면 선명한 Band 1개 외에 그 위쪽에도 흐릿한 band가 몇 개 더 있다는 것을 확인할 수 있다. 먼저, band가 여러개 분포하는 이유는 앞과 마찬가지로 Plasmid DNA의 다양한 형태 때문이다. 일반적으로는 supercoiled DNA가 주로 생성되지만, 실험 과정에서 조작을 잘못 하거나 다른 충격으로 인해 nick이 발생하면 open circular나 linear DNA이 발생할 수 있기 때문에 여러 개의 band가 생기는 것이다.
다음으로 여러 개 존재하는 band의 선명도의 차이는 에탄올과 관련이 있다. 이번 실험에서 사용한 PW buffer는 에탄올 성분을 포함하는데, 이를 원심분리로 제거한다. 그런데 원심분리를 통해 에탄올이 제대로 제거되지 않으면 이 에탄올이 DNA에 남아 전기영동 loading 시에 DNA가 가라앉지 않고 조금 뜨기 때문에 희미하게 측정되는 것이다. 따라서 더 정확한 실험을 진행하기 위해서는 원심분리를 더 진행해 정확히 에탄올을 제거해주거나 spin column의 필름을 충분히 건조시켜줘야 한다.
(2) 그 밖의 오차의 원인
- 실험 과정에서 발생할 수 있는 오차의 원인들을 살펴보자면, S1 Solution을 넣은 뒤에는 pipetting을 해주고, S2 Solution과 S3 Solution을 넣은 후에는 inverting으로 혼합을 해야 한다. 이렇게 혼합 방식을 달리 하는 이유는 S2와 S3 buffer를 넣은 뒤에는 격렬하게 pipetting을 해주면 Chromosomal DNA가 작게 분해되어 plasmid DNA와 크기 차이가 크게 나지 않아 분리가 힘들어지기 때문이다. 만약 S2,S3 buffer를 넣은 뒤에도 pipetting으로 혼합을 해주었다면 이러한 이유로 인해 오차가 발생할 수 있다고 생각한다. 또한, 실험 시 유의사항을 지키지 않거나 각 Buffer의 보관 조건을 지키지 않은 경우에도 오차가 발생할 수 있다.
5. Reference
[1] 김명원 외 9명, 생명과학 개념과 현상의 이해, PEARSON , page 186,210~212

키워드

생물화학공학,   화학공학,   화학공학실험,   생물실험,   플라스미드 DNA,   DNA,   결과레포트,   실험결과