Cellular Senescence Immunofluorescence 레포트

소개글

Cellular Senescence Immunofluorescence 레포트에 대한 보고서 자료입니다.

목차

Cellular Senescence Immunofluorescence
Ⅰ. 서론
Ⅱ.재료 및 방법
Ⅲ.결과
Ⅳ. 논의
Ⅴ.참고 문헌

본문내용

으로 검출하려면 2차 형광단 접합 항체를 사용할 때 달성되는 신호의 증폭이 필요하며 형광단 접합은 일차 항체의 친화력을 변경할 수 있다. Fab 단편을 사용하는 다양한 차단 기술 중 하나가 사용되거나 첫 번째 2차 항체가 형광단 결합 Fab 단편으로 대체되는 경우 동일한 종의 두 가지 일차 항체를 사용할 수 있다.(Fredrik et al, 2001)
GW182 계열 단백질은 동물 세포에서 microRNA 매개 유전자 침묵에 필수적이다. GW182 계열 단백질은 Argonaute 단백질과의 직접적인 상호 작용을 통해 miRNA 표적에 모집되고 표적 침묵을 촉진한다. 또한 이 단백질은 번역을 억제하고 mRNA 전환을 강화하는데, GW182 단백질의 정확한 작용 메커니즘은 완전히 이해되지 않았지만, 이 단백질은 세포질 폴리(A) 결합 단백질(PABP) 및 PAN2-PAN3 및 CCR4-NOT 데데닐라제 복합체와 상호작용하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 GW182 단백질이 miRNA 표적을 침묵시키는 다중 단백질 복합체의 조립을 위한 스캐폴드 단백질로 기능한다는 것을 시사하고 있다. (Joerg E. et al, 2012).
본 실험을 통해 Immunofluorescence의 방법과 원리를 이해한다. 또한 이를 통해 Proliferating cell과 Senescent cell에서의 단백질 GW182의 양상에 대해 비교하고 기술하는데 목적을 둔다.
Ⅱ.재료 및 방법
1X PBS를 통해 세포를 두 번 헹궈 준다. 10분 동안 RT에 3.7 % formaldehyde 더해 fixation 하여 준다. 다시 한 번 1X PBS를 이용하여 헹궈 준다. 5분 동안 0.2 % Triton X-100을 넣어 permeabilization 하여 준다. 첫 번째 샘플에 triton solution을 넣어준 후 타이머를 반드시 설정해 준다. 다시 한 번 1X PBS를 이용하여 헹궈 준다. 10 % normal goat serum을 통해 4 ºC에 하루 동안 blocking 하여 준다. 10 % normal goat serum을 제거한 후에 37 ºC 인큐베이터 안에서 한 시간 동안 각 coverslip 당 primary 항체와 10 % normal goat serum을 희석 변수 1:10 비율로 하여 100 μL을 넣어 준다. 1X PBS를 통해 5번 헹궈 준다. 37 ºC 인큐베이터 안에서 30분 동안 각 coverslip 당 secondary 항체와 10 % normal goat serum을 희석 변수 1:200 비율로 하여 100 μL을 넣어 준다. 빛 차단이 된 조건 하에 보관하여 준다. 다시 한 번 1X PBS를 통해 5번 헹궈 준다. 마지막으로 mounting 용액 40 μL을 슬라이드 중앙에 놓고 커버 슬립의 셀면을 아래로 향하게 하여 mounting 하여 준다. 이후 전자현미경 400배율로 세포를 관찰한 후 특징을 기술한다.
Ⅲ.결과
(1) Proliferating cell
광학현미경 X400
광학현미경 X400
광학현미경 X400
<그림1. GW182 표적 검출> <그림2.Proliferating cell DAPI> <그림3. GW182 표적 검출+DAPI>
(2) Senescent cell
광학현미경 X400
광학현미경 X400
광학현미경 X400
<그림4. GW182 표적 검출> <그림5.Senescent cell DAPI> <그림6. GW182 표적 검출+DAPI>
Proliferating cell의 GW182 단백질은 조밀하게 세포질 안에 가득 채워진 모습으로 관찰되며 DAPI를 통해 관찰한 핵 또한 조밀하며 형태 또한 일정하게 나타나 있다. GW182와 DAPI를 합한 모습을 통하여 GW182 단백질이 핵 주변을 둘러싸 세포질 안을 가득 채음을 확인할 수 있다. Senescent cell의 GW182 단백질은 특정한 형태를 관찰하기 어려우며 DAPI를 통한 관찰한 핵 역시 일정한 형태를 찾기 어렵다. 또한 Proliferating cell과 비교하였을 때 GW182 단백질의 밀도가 작고, 핵의 개수 또한 적다. GW182 단백질과 DAPI를 합한 모습을 통하여 세포의 개수와 GW182 단백질의 양 또한 Proliferating cell 보다 적은 상태임을 확인할 수 있다.
Ⅳ. 논의
본 실험을 통해 알 수 있는 사실은 크게 두 가지가 있는데 먼저, DAPI를 통한 핵의 분포이다. DAPI로 관찰한 Proliferating cell의 핵은 형태가 일정하며 빽

키워드

immunofluorescence,   indirect immunofluorescence,   antibody,   primary antibody,   secondary antibody,   DAPI,   rabbit antibody,   Senescent cellProliferating cell,