bioassay (생물학적방법)

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목차

1. 서 론

2. 이론적 배경
2. 1 항생 물질
2. 1. 1 항생 물질의 분류
2. 2 항생 물질의 발효 및 생산
2. 2. 1 항생 물질 생산에 영향을 주는 요인
2. 3 Cephalosporin C(CPC)
2. 4 Bioassay
2. 4. 1 확산법
2. 4. 2 중층법
2. 4. 3 희석법
2. 4. 4 비탁법
2. 5 간이 검정법

3. 실험방법
3. 1 실험 기구 및 시약
3. 1. 1 실험 준비
3. 1. 2 기타 실험 재료
3. 1. 3 실험 장치
3. 2 실험 방법
3. 2. 1 1CellCulture
3. 2. 2 Bioassay

Nomenclatures

본문내용

되어 탈색되고 저지대는 환원되지 않아 푸른 부분으로 남는다)으로 판정하는 방법등이 있으나 이와 같은 지시법을 사용하지 않더라도 단지 세균의 발육 유무에 따라서도 발육부분과 억제부분과의 한계는 뚜렷하다. 이 방법은 원통 평판법에 비하여 조작이 간단하며 피검물과 배양재료가 적게 들며 감도도 좋아 혈중 또는 척추액 중 항생물질의 유효농도나 혹은 오줌 중의 배설농도 등 임상적인 미량정량법으로 널리 응용된다.
[Fig 2-11]
2. 4. 3 희석법
최소발육저지 농도법
액체배지 혹은 고체배지를 사용하여 항생물질을 희석한 계열을 만든다. 한천희석법은 평판에 각종의 균을 도포하고 최저발육저지 농도를 조사하는 방법으로 향균 spectrum을 조사할 경우에 사용된다. 한천희석법(agar dilution method)은 한천도말법(agar streak method)하고도 한다.
2. 4. 4 비탁법
항생물질의 액체배지로 희석한 계열을 만들고 여기에 일정량의 피검균을 접종하고 30~37oC, 3-16시간 배양 후 가열 혹은 formalin 살균한 후 각 시험관의 탁도를 광전비색계로 읽는다. 기지농도의 액에 대하여 온도와 농도와의 표준곡선을 만들어 여기에 따라 피검액의 탁도에서 항생물질의 농도를 구한다.
2. 5 간이 검정법
일반적으로 낮은 농도 범위에 있어서 항생물질의 농도 C(unit/ml or ㎍/ml)와 저지원경 y(mm)와의 사이에는 (a,b 정수)의 관계가 성립하나고 가정하고 농도와 저지원경에 대하여 표준곡선을 작성하고 미지시료농도를 표준곡선에 의하여 구하는 방법이다.
(a) 제 1법
-표준적정곡선의 작성
petri dish에 5개의 원통을 세우고 그 각각에 상이한 농도의 기지농도 용액을 넣은 것을 10매, 별도로 전과 다른 농도용액에 대하여 10매, 계 20매의 petri dish를 이용하여 저지원을 형성시킨다.[2]
-미지시료농도의 검정
2매의 petri dish를 이용하여 그 각각에 5개의 원통을 세운다. 1매의 petri dish의 3개, 다른 petri dish의 2개의 원통에 기지농도용액 s(u/ml)을 넣고 나머지의 원통에 미지시료용액을 넣는다. 1매의 petri dish로 형성시킨 기지시료와 미지시료의 저지원경의 각각의 평균치를 ys와 yu로 한다. ys와 yu에 상당하는 농도를 표준곡선으로부터 읽고 s\'와 u\'를 얻는다. 미지시료용액의 농도 u(u/ml)은 에 의해서 구한다. 다른 petri dish에 대해서도 같은 방법으로 미지시료용액의 농도를 구하고 2매의 petri dish에서 얻은 농도를 평균하여 미지시료농도로 한다.
(b)제 2법
-표준곡선의 자성
1매의 petri dish에 4내지 6개의 원통을 세운다. 반절의 원통에는 기준농도 용액(다른 농도에서 얻은 저지원경을 수정하는 기준이 되는 농도용액)을 나머지의 원통에는 틀리는 농도용액을 넣는다. 각각의 농도에 대하여 3매의 petri dish를 사용한다. 모든 petri dish에서 형성한 기준농도용액의 저지원경의 평균피를 ys, 동일한 petri dish에 있는 농도의 저지원경의 평균치를 yx, 그 petri dish의 기준농도용액의 저지원경의 평균치를 y\'s라 하고 그 농도의 저지원경(보정치) yx를 를 이용해서 구한다. 각각의 농도에 대하여 저지원경을 구하여 표준곡선을 작성한다.[2]
-미지시료농도의 검정
표준곡선의 작성과 같은 방법으로 실험을 행한다. 미지시료에서의 저지원경의 보정도 윗 식에 의하여 행하고 표준곡선으로부터 농도를 구한다.[2]
3. 실험방법
3. 1. 실험기구 및 시약
3. 1. 1 실험준비
1) 배양균 - cephlosporin acremonium M25
2) 검정균 - alcaligenes faecalis ATCC 8750
3) 항생물질 - cephalosporin C
4) Main medium
①1.95% glucose ②0.8%(NH4)2SO4
③0.5%DL-methionine ④0.3%KH2HPO4
⑤0.5%K2HPO4 ⑥5.5% corn steep liquor
⑦0.4% trace element solution ⑧5% rice oil
5) Nutrient Agar(/liter)
①beefExtract 3.0g
②peptone 5.0g
③agar 15.0g[4]
3. 1. 2 기타실험재료
1) petri dish
2) pipet
3) tip
4) flask
5) eppendrof tube
6) paper disk
7) poly globe
8) sealing paper
9) 비닐 랩
10) 솜 혹은 flask 마개
11) 70% Ethanol
12) kimswipes
13) 분무기
14) 핀셋[4]
3. 1. 3 실험장치
1) Clean bench
2) microcentrifuge
3) shaking incubator
4) autoclave
3. 2 실험방법
3. 2. 1 Cell Culture
1) main medium 15ml를 다음과 같이 만든다.
①1.95% glucose
②0.8%(NH4)2SO4
③0.5%DL-methionine
④0.3%KH2HPO4
⑤0.5%K2HPO4
⑥5.5% corn steep liquor
⑦0.4% trace element solution
⑧5% rice oil
2)위에서 만든 main medium 15ml를 250ml flask 2개에 각각 넣고 마개로 막은 후 알루미늄 랩으로 마개를 싼다.
3) 2개의 flask를 autoclave에 넣고 120℃, 20분간 가열하여 멸균한다.
4) Clean bench를 열어서 70% ethanol을 이용하여 소독한다.
5)어느 정도 autoclave가 식은 다음(60～70℃)에 flask 2개를 꺼내어 clean bench에 넣어둔다. 이때 약간의 70% ethanol을 QN리고 잘 말려서 poly globe를 끼고 실험 을 실시한다.
6)Clean bench에 넣어둔 flask가 완전히 식으면(상온) clean benchso에서 seed culture한 cephlosporin acremonium M25 cell을 10%로 접종한다.
7)접종한 main flask를 300rpm, 27℃로

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