대장균의 DNA의 추출과 정량

소개글

대장균의 DNA의 추출과 정량에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.Abstract

2.Introduction
1)DNA
2)Escherichia.coli(E.coli)
3)분광광도계
4)흡광도
5)Cell lysis (CW, CM파괴)
6)EDTA
7)Dnase
3.Meterials & Methods
4.Results
5.Discussion

본문내용

시약을 첨가하여 발색을 이용한 spetrophotometer를 사용하게 된다면 파장은 달라질 수도 있다. 즉 같은 protein이기는 하지만 특정 protein을 탐지하는 시약을 첨가하여 발색반응으로 측정한다면 280nm이 아닌 해당 발색의 색깔에 따라 파장이 달라진다는 얘기이다.
4)흡광도
세기 I0를 가진 어떤 빛이 용액층을 통과한 후에 광도가 I가 되면, 그 양은 log10(I0/I)으로 정의된다. 람베르트-베르의 법칙이 성립하는 경우에 log10(I0/I)＝εcd의 관계가 성립한다. ε은 몰흡광계수, c는 용액의 몰농도, d는 액층의 두께를 나타낸다. 따라서 ε과 d를 알면 광학밀도 측정으로 농도 c를 결정할 수 있다.
그러나 흡광도 등의 정의는 상당히 애매하며, log10(I0/I)를 흡광도라 하고 흡광도를 d로 나눈 값을 광학밀도라고 하는 경우도 있다. 이 경우 O.D.는 람베르트베르의 법칙이 성립하는 한 εc와 같고, 따라서 용질의 농도에 비례한다. 그러므로 어떤 표준상황에서 O.D.를 알면 그 물질의 용액의 O.D.를 측정함으로써 농도를 구할 수 있다.
단백질의 경우, 그 1% 용액 280nm의 O.D.를 기준으로 잡고, 단백질용액의 O.D.를 측정하여 이것을 14.0으로 나누면 그 퍼센트농도를 얻을 수 있다. 이와 같이 O.D.는 농도에 비례하는 양이며, 핵산이나 핵단백질의 절대량을 나타내는 데 쓰인다. 이 경우에는 그 물질을 1mℓ의 용액으로 만들었을 때, 260nm의 O.D.가 1이 되는 양을 1 O.D.단위라고 한다.
예를 들면 RNA파지의 1mg을 1mℓ에 용해하면 O.D.는 대체로 8이 되므로, 1mg은 8 O.D.단위에 상당하고, 거꾸로 RNA파지 1 O.D.단위는 1/8mg이 된다. 이 경우에도 흡광도를 O.D.와 마찬가지로 d=1cm인 경우라고 정의하여 A260 단위로 나타내는 일도 있다. RNA파지 1mg은 8 A260 단위가 된다.
핵산에 의하여 흡수되는 빛의 양은 분자의 구조에 의하여 달라진다. 구조가 질서잇게 정돈되어 있으면 있을수록 흡수도는 적어진다. 그러므로, 유리 뉴클레오티드들은 단일가닥의 DNA나 RNA보다 많은 빛을 흡수하고, 단일가닥의 DNA나 RNA는 이중가닥의 DNA보다 많은 양의 빛을 흡수한다. 이중가닥 DNA의 A260=1.00 이고, 단일가닥 DNA의 A260=1.37 이고, 유리 염기의 A260=1.60 임을 보면 알 수 있다.
5)Cell lysis (CW, CM파괴)
물리적 방법과 화학적 방법이 있다. DNA 분리에는 주로 화학적 방법을 이용한다. 세포벽을 약화시키기 위해 lysozyme, EDTA또는 두가지 모두를 사용한다. 때로는 SDS를 사용하기도 한다.
6)EDTA
화학식은 C10H16N2O8 이다. 에틸렌디아민테트라아세트산이라고도 한다.거의 모든 금속이온과 안정한 수용성 킬레이트를 만든다. EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. DNA추출 실험에서 이 과정에서는 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것이다. 이번 실험에서 EDTA를 넣는 이유가 Dnase를 억제하기 위해서이다.
7)Dnase
뉴클리아제(nuclease)는 핵산을 해중합(depolymerization)시키는 효소이다. 대부분 뉴클리아제는 화학적 특이성을 가지고 있으며 크게 Dnase와 Rnase로 나눈다. 대부분 Dnase는 단일가닥 DNA또는 이중가닥 DNA중 어느하나에만 작용하지만 어떤 Dnase는 두가지 DNA 모두에 작용하는 것도 있다.
3.Meterials & Methods
M.tube에 1.5mL의 E.coli배양액을 넣고, 11,000rpm에서 1min간 원심분리한 후 상층액을 제거한다. 이것을 2회 반복한다. 원심분리를 할 때 tube를 같은 방향으로 넣어햐 한다. Pellet에 1mL의 0.01M EDTA용액(pH 8.0)을 가해서 vortering시킨 후, resuspend solution을 20mL 비커로 옮긴다. 10%의 SDS 용액 3방울(150μL)과 1N NaOH 1방울(50μL)을 가하고 천천히 잘 섞는다. 이것은 완전히 DNA가 빠져나오도록 하기 위한 것이다. DNA는 알콜에

키워드

DNA,   대장균,   분광광도계,   흡광도,   EDTA,   Dnase