DNA의정량적분석

소개글

DNA의정량적분석에 대한 보고서 자료입니다.

목차

DNA의 사전적 의미.

DNA의 분자구조.

DNA 정량검정과정.

정량분석의 사전적 의미(quantitative analysis).

DNA의 정량적분석의 원리.
(용어정리)
-분광광도계
-흡광도

UV분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하는 원리를 이용한 실험들

Real Time PCR를 이용한 DNA정량

References

본문내용

변화를 관찰함으로서 분자의 전자구조적 성질을 파악할 수 있다.
정성분석에서는 분자의 구조분석 (최대흡수파장, 흡광도, ε의 크기, band의 분리형태등을 종합적으로 해석)에 이용되며 순도확인 및 정량분석에도 널리 사용된다.
적외선분광광도계
분자중에 적외선이 조사되면 이 중에서 분자내 원자간의 결합 구조에 따른 고유한 진동에너지 영역의 파장(2.5-25 μm = 4000-400 cm-1의 범위)을 흡수 후 방출하게 되는데 이러한 변화를 측정한다.
원자 흡광 분광계
원자흡광법은 금속 원자를 불꽃 또는 전기로등에 의하여 높은 온도로 가열함으로써 만들어진 기체 상태의 중성 원자에 적당한 복사에너지(자외선)을 쪼여줌으로써 일어나는 복사에너지 흡수 현상을 기초로 한 분석법이다. 이 방법은 극미량의 원소를 정확하게 분석할 수 있다.
흡광도
세기 I0를 가진 어떤 빛이 용액층을 통과한 후에 광도가 I가 되면, 그 양은 log10(I0/I)으로 정의된다. 람베르트-베르의 법칙이 성립하는 경우에 log10(I0/I)＝εcd의 관계가 성립한다. ε은 몰흡광계수, c는 용액의 몰농도, d는 액층의 두께를 나타낸다. 따라서 ε과 d를 알면 광학밀도 측정으로 농도 c를 결정할 수 있다.
그러나 흡광도 등의 정의는 상당히 애매하며, log10(I0/I)를 흡광도라 하고 흡광도를 d로 나눈 값을 광학밀도라고 하는 경우도 있다. 이 경우 O.D.는 람베르트베르의 법칙이 성립하는 한 εc와 같고, 따라서 용질의 농도에 비례한다. 그러므로 어떤 표준상황에서 O.D.를 알면 그 물질의 용액의 O.D.를 측정함으로써 농도를 구할 수 있다.
단백질의 경우, 그 1% 용액 280nm의 O.D.를 기준으로 잡고, 단백질용액의 O.D.를 측정하여 이것을 14.0으로 나누면 그 퍼센트농도를 얻을 수 있다. 이와 같이 O.D.는 농도에 비례하는 양이며, 핵산이나 핵단백질의 절대량을 나타내는 데 쓰인다. 이 경우에는 그 물질을 1mℓ의 용액으로 만들었을 때, 260nm의 O.D.가 1이 되는 양을 1 O.D.단위라고 한다.
예를 들면 RNA파지의 1mg을 1mℓ에 용해하면 O.D.는 대체로 8이 되므로, 1mg은 8 O.D.단위에 상당하고, 거꾸로 RNA파지 1 O.D.단위는 1/8mg이 된다. 이 경우에도 흡광도를 O.D.와 마찬가지로 d=1cm인 경우라고 정의하여 A260 단위로 나타내는 일도 있다. RNA파지 1mg은 8 A260 단위가 된다.
핵산에 의하여 흡수되는 빛의 양은 분자의 구조에 의하여 달라진다. 구조가 질서잇게 정돈되어 있으면 있을수록 흡수도는 적어진다. 그러므로, 유리 뉴클레오티드들은 단일가닥의 DNA나 RNA보다 많은 빛을 흡수하고, 단일가닥의 DNA나 RNA는 이중가닥의 DNA보다 많은 양의 빛을 흡수한다. 이중가닥 DNA의 A260=1.00 이고, 단일가닥 DNA의 A260=1.37 이고, 유리 염기의 A260=1.60 임을 보면 알 수 있다.
Ⅰ)UV분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하는 원리를 이용한 실험들.
ⅰ)디페닐아민 분석법에 의한 DNA정량
디페닐아민반응
디셰반응 : 디옥시펜토오스의 발색반응이다.
미량의 검사체를 물에 녹이고 20% 디페닐아민의 알코올 용액 몇 방울을 첨가하고 여기에 진한 황산 1ml를 첨가하여 끓는 물로 중탕하여 10분간 가열한다. 이 반응은 DNA의 정량분석에 응용된다. DNA를 함유하는 검사체에 그 2배의 디페닐아민 시약을 첨가하여 100℃로 10분간 가열하면 청색을 띤다. 이 색은 상당히 안정하고 595nm에 흡수극대를 가지고 있다. 또 이 반응은 상당히 특이성이 있고 다른 종의 당류에서 같은 파장의 흡수를 가지고 있는 것은 적다. DNA를 구성하는 뉴클레오티드 중 발색에 관계하는 것은 퓨린디옥시뉴클레오티드이며 피리미딘의 뉴클레오티드는 발색하지 않거나 또는 극히 조금밖에 발색하지 않는다.
Meterials & Methods
① 시험관 5개에 각각 0ml, 0.5ml, 1ml, 1.5ml씩 취한 다음에 1 X SSC용액으로 각각 최종 부피가 1.5ml이 되도록 채운다.
DNA soln. (ml/conc.)
0
0.5(0.16)
1(0.33)
1.5(0.5)
1.5
1 X SSC (ml)
1.5
1
0.5
0
0
Diphenylamine (ml)
6
6
6
6
6
② 이들 각각의 시험관에 6ml의 디페닐아민 시약을 가하여 섞고, 끓는 물 중탕에서 10분간 열한 다음 시험관을 냉각시킨다.
③ 600nm의 파장에서 각 용액의 흡광도를 분석하고, 미지 시료의 흡광도를 측정하여 농도 를 추정한다.
Discussion
어떤 시료에 대해 하나 이상의 성분의 양이나 비율을 결정하는 화학 분석법을 정량분석이라 한다. 이번 실험은 디페아닐아민 분석법에의한 DNA 정량분석이 실험을 통해 다루어졌다.
DNA는 산성인 상태에서 디페아닐아민과 반응하여 푸른색의 발색반응을 일으킨다. DNA를 구성하는 뉴클레오티드 중 발색에 관계하는 것은 퓨린디옥시뉴클레오티드이며 피리미딘의 뉴클레오티드는 발색하지 않거나 또는 극히 조금밖에 발색하지 않는다. 이러한 발색반응으로 흡광도를 구함으로써 단백질 정량실험과 같은 방식으로 DNA의 농도를 측정할 수 있는 것이다.
우선 각각의 시험관에 용액들을 정해진 부피에 맞게 채운다. 여기서 1 X SSC는 pH를 조절하기 위해 넣는 것이나 4번과 5번 실험관에는 넣지 않는 이유는 DNA용액속에 이미 그 용액이 포함되어 있기 때문에 크게 문제될것이 없는 것이 없다.
ⅱ)대장균 DNA 정량실험
Meterials & Methods
M.tube에 1.5mL의 E.coli배양액을 넣고, 11,000rpm에서 1min간 원심분리한 후 상층액을 제거한다. 이것을 2회 반복한다. 원심분리를 할 때 tube를 같은 방향으로 넣어햐 한다. Pellet에 1mL의 0.01M EDTA용액(pH 8.0)을 가해서 vortering시킨 후, resuspend solution을 20mL 비커로 옮긴다. 10%의 SDS 용액 3방울(150μL)과 1N NaOH 1방울(50μL)을 가하고 천천히 잘 섞는다. 이것은 완전히 DNA가 빠져나오도록 하기 위한 것이다. DNA는 알콜에

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