DNA 추출 (식물유전체 DNA) 전기영동

소개글

DNA 추출 (식물유전체 DNA) 전기영동에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

같은 양의 이소프로필 알코올을 넣는다. 상층액을 피펫을 이용하여 새로운 튜브로 옮길 때 상층부에 있는 불순물이 함께 들어가면 여러 겹의 거즈를 이용하여 거른다.
⑺튜브를 4˚C에서 20,000×g로 15분간 원심 분리한다.
⑻ 상층액을 조심스럽게 모두 따라 버린 후, 침전된 DNA 침전물을 씻은 다음 20,000×g에서 2~3분간 원심분리한다.
⑼ 상층액을 모두 따라 버린다음, 깨끗한 필터 위에 튜브를 뒤집어 10~20분 정도 공기 중에 놓아두어 모든 에탄올이 증발 하도록 한다.
⑽DNA 침전물을 200μl의 증류수나 TE(10mM Tris-1mM EDTA, pH 7.5)로 녹인다.
⑾10μl를 취한 후 아가로오스 전기영동을 통해서 추출된 DNA의 양과 젤에서의 유전체 DNA의 양상을 조사한다. 나머지는 -20˚C 냉동실에 보관한다.
Amount of agarose in gel(%[w/v])
Efficient range of separation oflinear DNA molecules (kb)
0.3
5~60
0.6
1~20
0.7
0.8~10
0.9
0.5~7
1.2
0.4~6
1.5
0.2~3
2.0
0.1~2
1. agarose와 증류수를 섞고 가열한 후 EtBr을 넣는다.

1 x TBE용액으로 희석하여 99mL에 agarose 0.8g(0.8%)을 섞어서 0.8%로 만든다. 열을 가하여 완전용해 시키고, EtBr을 넣고 잘 섞은 후 뜨거운 용액을 식힌 후 젤을 굳히는 판에 붓고 comb을 꽂고 식을 때까지 기다린다.
2. 잘 섞은 뒤 주형에 넣고 굳혀서 agarose gel을 만든다.(굳힐 때는 comb를 끼워서 well을 만든다.)
3. 전기영동장치에 1 x TBE를 넣은 후 gel을 넣는다.
4. well의 가장왼편에 size maker를 넣고 차례로 loading dye와 DNA를 섞은(1:5정도) solution을 주입한다.
5. 전기를 걸어준 뒤 20~30분 기다린다
6. DNA가 내려오면 자외선 하에서 확인한다.
* 낮은 전압에서 선형으로 된 DNA조각의 이동속도는 부하되는 전압에 비례한다. 그러나 전기장에서 전류의 흐름이 커짐에 따라 높은 분자량을 가진 DNA조각의 이동속도는 빨라지게 되므로 전압이 올라감에 따라 agarose gel에서 DNA분리효과가 감소된다. 2 kb보다 큰 DNA조각들의 분리를 최대로 하기위해서는 agarose gel에 5 V/cm 이상의 전압을 부하시켜서는 안된다.
* 전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문이다.
* Gel에 ethidium bromide가 함유되어 있으면 전기영동 하는 동안 어느 시기에나 자외선하에서 관찰이 가능하다. 그러나 gel에 ethidium bromide를 함유시키지 않고 전기영동한 후 gel을 ethidium bromide가 0.5 μg/ml 포함된 용액에 30~45분간 더 염색하였다가 관찰하는 것이 더 선명한 DNA 띠를 관찰할 수 있다는 이유로 후자를 선호하는 실험자들도 있다. 이때 탈색과정은 보통 필요치 않으나, 10 ng 이하의 적은양의 DNA를 검출할 때 에는 결합하지 않은 ethidium bromide가 gel에 묻어있으면 바탕이 흐려보이므로 증류수나 1mM MgSO4에 담가 실온에서 20분간 탈색하면 DNA를 더 선명하게 관찰할 수 있다.

1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.
4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.
6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.
7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.
*DNA loading dye
Agarose의 well에 DNA를 넣어줄 때 DNA용액을 무겁게 하여 agarose의 well로 가라앉히는 역할을 하며 그 성분에 전기영동 되는 속도가 다른 두개의 염색시약이 들어있어 DNA와 같이 전기영동되며 DNA의 전기영동 된 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
*전기영동 buffer
TAE (Tris acetate EDTA) : DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓰인다.
TBE (Tris borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
Commonly used electrophoresis buffers
Buffer
Concentrated stock solution (per liter)
Tris-acetate (TAE)
50x
242 g Tris base
57.1 ml glacial acetic acid
100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
Generally used for agarose EP
Tris-borate (TBE)
20x
121.1 g Tris base
61.7 g boric acid
7.44 g Na2EDTA-2H2O
Generally used for DNA sequencing
◆고 찰
지난학기에 배웠던 전기영동을 직접해보니 좀 더 머리에 와 닿는 느낌이었다. 이론상 배울 때에는 사실 외우기에 급급했지 머릿속으로 깊게 이해되진 않았었다. DNA추출 같은 경우 의외로 직접하는 시간보다 기다리는 시간이 더 많았던 듯하다. DNA추출은 생명공학을 전공으로 하는 학생으로서 앞으로 쓰일 때가 많을테니 방법을 이해하고 할 수 있어야겠다.
◆ 참고문헌
유전학실험서 - 라이프 사이언스
필수 유전학 제4판 - 월드 사이언스
유전공학개론
기초유전자학 - 월드 사이언스
알기쉬운 유전자공학 - 고려의학
◆결 과

키워드

dna,   전기영동,   유전학실험,   식물체유전자,   아가로스겔,   아가로스젤,   dna추출,   dna분리