Knock out method를 통한 Synechocystics sp. PCC 6803 의 target gene function 규명

소개글

Knock out method를 통한 Synechocystics sp. PCC 6803 의 target gene function 규명에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Introduction
Knock out method 에 관한 조사
2. Materials & Methods
3. Result
4. Discussion
5. Note
6. reference

본문내용

한 만큼 rpm, 조작법 등이 다르다. 일반적인 PCR은 tube를 꽂은 well 하나하나의 온도가 올라갔다 내려갔다를 반복한다. 그러나 gradient PCR은 well 하나하나의 온도가 달라 조건을 다르게 setting해야 해서 몇 도가 최적인지를 모르는 단점이 있다.
PCR을 시행할 때 가장 중요한 것은 balance를 맞추는 것이다. 마주보는 tube끼리의 무게를 맞춰주면 되는데, 이것을 간과하면 큰 사고가 날 수 있다. PCR의 시간과 온도를 입력하는데, 우리는 온도를 25℃에 맞추었다. 이것은 cyanobacteria가 그 이하의 온도에서는 stress를 받기 때문이다. 모든 절차가 끝나고 PCR을 작동시키면 rpm이 올라가고 cell이 down되어 pellet을 얻을 수 있다.
PCR을 돌린 후 전기영동을 실시하면 그 결과가 다양하게 나타날 수 있다(실험 중에 넣어주는 것들이 많아 변수가 많아지게 된다). 첫 번째로, band가 안 나타날 수 있다. 이것은 여러 요인을 생각해볼 수 있는데, primer TM값이 너무 높거나 낮아서, 또는 forward, reverse primer 2개가 서로 반응했기 때문에, 또는 hair-pin 구조가 형성 되었기 때문으로 추측할 수 있다(주형이 결과에 영향을 미치므로 잘 만드는 것이 중요하다). 두 번째로, 여러 개의 band가 나타날 수 있다. 이것은 specific binding이 이루어지지 않았기 때문이다(annealing 시기에 온도를 높여줌으로써 해결할 수 있다).
5. Note
▶ agarose gel을 만들 때 EtBr을 넣으면 염색과정이 필요 없다.
장 점
단 점
절차가 간소해 진다.
전기영동시 UV를 비춰 DNA의 이동을 바로 확인할 수 있다.
DNA의 이동속도가 15% 늦어진다.
전기영동시 EtBr이 없으면 Sharp한 band를 얻을 수 있다.
DNA의 형태에 따라 EtBr의 결합정도가 달라져서 natural한 pattern을 보기 어렵다.
전기영동 tank 및 gel tray가 EtBr에 오염된다.
단, 그 차이는 그리 크지 않으므로 실험실마다 선호하는 방법이 다르다.
▶ PCR이 이용되는 실험
- probe로 사용할 목적으로 cloning된 이중가닥 DNA의 증폭
- 적은 양의 mRNA로부터 특정 cDNA의 cloning
- DNA sequencing, -돌연변이 검사
- 병인성 바이러스 및 박테리아 검출
- 유전자의 footprinting
- 특정 부위에 돌연변이를 일으킨 유전자의 제조(site directed mutagenesis)
▶ PCR의 의학적 응용
- HLA형의 결정
- 법의학 : 특정인의 유전자 검출
- 암유전자의 검출 : ras, myc, fos 등
- 유전성 질병의 진단: Progressive muscular dystrophy(Duchenne type)등
- 감염성 질병의 진단: Streptococcus, Salmonella, Hepatitis virus 등
6. reference
http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_13.php
http://blog.naver.com/jagiya97?Redirect=Log&logNo=120003093255
http://blog.naver.com/lkh0426?Redirect=Log&logNo=100037122152
http://kin.naver.com/db/detail.php?d1id=11&dir_id=110205&eid=42eFjPzxqqEtuGoYOjtYgn6uRmu/RuaN& qb=QnJvbW9waGVub2wgYmx1ZSBkeWU=

키워드

Knock out method,   Cyanobacteria ,   vector,   Taq DNA polymerase ,   gene cloning