LM-PCR & DD-PCR

소개글

LM-PCR & DD-PCR에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Ligation-mediated PCR (LM-PCR) for genomic sequencing and footprinting
(1) 서론
(2) Materials and Methods

2.1 Genome DNA Preparation
2.2 Chemical Cleavage
2.3 First Primer Extension
2.4 Ligation
2.5. PCR
2.6. Gel Electrophoresis
2.7 Electroblotting
2.8 혼성화 합성 탐침
2.9 Hybridization



2. Differential display of mRNA by PCR (substraction library technique)

1. 서론
2. DD 기법의 장점
3. DD 기법의 단점 및 한
3.1 오류적 포지티브
3.2 드문 cDNA를 감지하는 데 있어서의 민감성
3.3 재생성
4. DD 기법 성능 최적화
4.1 시작 표본
4.2. Primer
4.3 겔 표시(display)
4.5 DD 밴드 식별

5. 기타 변경 및 밀접하게 관련된 기법들
5.1 목표 DD (Targeted DD)
5.2 제한 조각 길이 동질이상-결합 영역-유도 DD
5.3 순서화된 DD

6. DD 기법에 대한 대안
6.1. 표현 차이 분석기법 (Representational Difference Analysis, RDA)
6.2 Suppression Subtractive Hybridization (SSH)
6.3 감법 DD
6.4. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
6.5 cDNA Array Hybridization Technique

7. Materials and Methods

8. 결론

본문내용

11. 200 U/ul MMLV reverse transcriptase를 1ul tube에 mix 시켜서, 37℃에서 50분간 incubation.
12. 95℃에서 5분간 reverse transcriptase를 inactivation 시키고, microcentrifuge에서 high speed로 collect condensation시킨다. PCR amplification은 즉시 ice 박아두어 사용하거나 나중에 쓸거면 20℃에 보관한다.(적어도 6개월 안정적)
13. Prepare a 20 ul reaction mix for each primer set as follows:
· 9.2ul H2O
· 2ul 10x amplification buffer (1x final)
· 1.6ul 25uM 4dNTP mix (2uM final)
· 1ul 10uCi/ul [α-35S]dATP
· 2ul 10uM degenerate anchored oligo(dT) primer set (T12MN; 1 uM)
· 2ul cDNA (step 10)
· 0.2ul 5U/ul Taq DNA polymerase
· 2ul 2uM arbitrary decamer (0.2 uM final)
14. 파이펫으로 up and down 하면서 섞은 후 25ul 미네랄 오일을 덮는다.
15 .Carry out PCR in a thermal cycler using the following amplification cycles:
· 40 cycles: 30 sec 94℃ (denaturation)
· 2 min 40℃ (annealing)
· 30 sec 72℃ (extension)
· 1 cycle: 5 min 72℃ (extension)
· Final step: indefinitely 4℃ (hold)
16. 3.5 ul PCR product와 2 ul formamide loading buffer와 섞고 80℃에서 2분 incubation한다. 6% denaturing polyacrylamide gel에 sample을 loading한다. 60W ~3시간정도 까지 바닥에 10 cm안으로 gel을 run시킨다.
17. 조심스럽게 glass gel plate를 제거한다. gel위에 Whatman 3MM filter paper를 올리고 gel과 filter paper 사이의 air bubbles를 제거한다. R.T에서 1시간 이내로 dry 시킨다.
18. radioactive ink나 needle punches를 이용하여 x-ray film에 mark하고 건조된 gel에 그것들을 맞춘다. R.T에서 gel을 24시간에서 48시간동안 Autoradiograph한다.
19. gel에서 온 film을 develop 시키고, 필요한 DNA band(differentially display된 다른 lane들)에 필름 아래에 깨끗한 pencil로 표시하거나 조금 잘라서 표시해도 된다.
20. gel을 slice로 자르고 Whatman 3MM filter paper에 부착한다. 그리고 razer blade를 이용하여 microcentrifuge tube안에 넣고 100 ul H2O를 넣고 R.T에서 10분간 incubation한다.
21. tube cap을 세게 닫고 15분간 끓인다.
22. microcentrifuge로 2분간 high speed로 한 후 gel slice와 paper debris인 pellet을 두고 깨끗한 tube에 상층액을 붓는다.
23. 옮긴 상층액에 3 M sodium acetate (to give 0.3 M final)을 10 ul 첨가하고 10 mg/ml glycogen (as a carrier)를 5 ul 첨가한다. 100% ethanol을 400 ul 첨가하고 70℃에 30분간 incubate한다. 그리고 Microcentrifuge 10 min at high speed, 4℃.
24. pellet에는 85% ethanol 500 ul로 씻고, air dry 후 H2O 10ul로 DNA를 녹인다.
25 녹인 DNA 4 ul를 다시 증폭시킨다. 40 ul 반응 volume을 사용한다. 같은 degenerate anchored oligo(dT) primer set을 사용하고 13에서 15 step으로 PCR을 진행한다. 1.6 ul of 250 uM 4dNTP mix (20 uM final)을 첨가하는 것을 제외하고 대신에 1.6 ul of 25 uM 4dNTP mix and omit isotope을 넣는다. 후에 reamplification할 DNA는 20℃에 보관(무기한 안정한 상태)
26. PCR sample을 0.5 ug/ml ethidium bromide에 stain해서 1.5% agarose gel에 30ul 전기영동한다. 남은 PCR sample들은 20℃에 보관. (stable for years)
27. agarose gel로부터 reamplified DNA band를 추출하여서 northern blot 분석과 cDNA library screening을 위한 probe로 사용한다.
28. subcloning과 sequencing을 이용하여 남아있는 PCR sample(26 step)을 characterize 시킨다.
8. 결론
DD 기법은 추정 차별 발현 유전자들을 신속하게 식별한다. 오류적 포지티브 반응을 없애려면, 식별된 cDNA를 실제 차별 발현 여부를 판단하기 위한 탐침으로써 사용하는 Northern 분석과 같은 검사 기법이 필요하다. DD 기법의 주요 장점으로는, 많은 수의 RNA 집단들이 한 번의 실험에서 비교될 수 있으며, 따라서 공동으로 차별 발현되는 밴드들을 용이하게 식별할 수 있다는 점이다. RDA나 SSH와 같은 기법을 사용한 사전 감법(prior subtraction)에 의해서 DD 기법의 시작 물질의 복잡한 특징이 줄어들 수도 있다. DD 기법은 높은 효율성을 가지는 cDNA 어레이 기술들의 개발에 의해서 대체될 것으로 보이지만, 그 동안에는, DD 기법은 차별 유전자 발현을 분석하기 위한 유용한 기법으로 남아있을 것이다.

키워드

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