[생화학 실험보고서] Protein over expression in E. coli and purification by affinity chromatography

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[생화학 실험보고서] Protein over expression in E. coli and purification by affinity chromatography에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

otein을 제거하기 위한 washing buffer에 target protein이 딸려 내려온 것은 20 mM imidazole concentration이 우리가 넣은 6X-His tagged protein을 washing하는데 약간 높은 농도임을 알 수 있다(선행실험과 비교하였을 때 resuspension이 잘 이루어지지 않아 affinity chromatography를 실시한 총 양이 더 적다.).
3) Elution 1~4를 비교하였을 때, 1번과 4번에 비해 2번과 3번에서의 target protein의 양(or yield)이 더 많다. 이는 elution을 처음 시작할 때와 마지막으로 양이 얼마 남지 않았을 때보다 elution 중간과정에서 수득되는 target protein의 양이 더 많은 것으로 해석 가능하고, 실험에 전체적인 오류가 없는 것으로 생각할 수 있다.
4) Purification은 거의 변화가 없으면서 yield를 많이 감소시키는 step은 처음 centrifugation과 Flow-through step이다(이는 Supernatant의 purification, yield와 PPT의 yield, Flow-through의 yeild를 확인하여 얻어낼 수 있는 결과이다. PPT, F/T, washing의 purification은 상대적으로 덜 유익한 정보를 갖는다고 할 수 있다.). PPT와 F/T에서 Yield가 높은 것은 각각 resuspension이 제대로 이루어지지 않은 cell에 포함된 target protein과 F/T에서 bead에 affinity binding하지 못하고 떨어져 나간 target protein 때문이다. 하지만 두 가지 step 모두 꼭 필요한 step이므로 resuspension, resin equilibrium을 보다 신경써 수행하여야 할 것이다.
5) 실험에 사용된 모든 buffer에는 NaPi(pH 7.4, Na2HPO4, NaH2PO4), 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, DTT를 포함하고 있다. 이들은 각각 pH를 일정한 값으로 유지(protein의 pI 값), protein의 charge 보완, disulfide bond를 제거하여 protein의 native form 유지라는 목적으로 이용되었다.
6) 우리는 10 ml의 E. coli를 배양하여 총 940 ㎍의 target protein을 수득하였다. 만약 10 mg 의 target protein을 얻고 싶다면
10 ml : x ml = 940 ㎍ : 10000 ㎍, ∴ x = 106.38 ml
따라서 106.38 ml의 E. coli를 배양해야 10 mg양의 target protein을 얻어낼 수 있다.
7. 참고문헌
1) 생화학실험(2) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
2) Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. 2007, Biochemistry, sixth ed.
3) http://en.wikipedia.org/wiki/

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