2. 순수 분리 및 배양(도말평판법, 주입평판법)

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고 다시 산소가 녹지 않도록 대기중의 산소를 제거하는 조작이 필요하다. 또한 배지에는 환원제를 첨가하여 낮은 산화환워전위를 유지해야한다.
E.Coli(Escherichia coli)는 한국생명공학연구원에서 no.1039를 사용했다. E.Coli은 유기산을 생성하기 때문에 흔들면 공기방울이 생긴다.
계대 배양 시에는 배양할 배지의 종류와 계대배양의 시기 선택은 물론, 무균적으로 실시하는 것이 중요하다. 따라서 외부의 오염된 공기와 분리된 무균대에서 계대배양을 실시해야 한다.
세균의 계대배양에 사용되는 도구는 주로 백금선, 백금이를 사용한다. 백금선은 금속성의 손잡이에 열의 전도성이 높은 니크롬이나 백금선을 끼운 것이며, 백금이는 백금선의 끝에 직경 3mm정도의 원형을 만들어 사용하는 것이다. 백금이는 원형 부분에 액체가 얇은 막 형태로 맺히게 되므로 액체배양액의 계대배양에 이용할 수 있다. 백금선은 끝부분이 뾰족하므로 고체배지에 찔러서 계대배양을 할 수 있다. 백금선과 백금이는 사용할 때마다 분젠버너나 알콜램프등을 이용한 화염멸균법(flame sterilization)을 실시 후 사용한다.
화염멸균법은 고열에 손상되지 않은 물체를 불꽃에 직접 가열시켜서 표면에 붙어 있는 미생물을 태워 죽이는 방법이다. 알코올 램프나 LPG가스를 이용하여 백금이, 유리기구, 금속기구 등을 멸균한다. 이때 화염멸균한 백금이를 식히지 않고 그대로 균을 따면(fishing하면) 균은 단백질로 구성되어 있으므로 열에 의해 응고되어 죽기 때문에 식혀야 한다.
실험을 할 때 몇가지 주의사항이 있다. 균은 공중에 오래 두면 오염된다. 항상 오염에 주의해야 한다. 피펫으로 균주를 딸 때(균주액에 피펫을 담가 균주액을 취하는 것) 불 근처에서 사용해야 한다. 멸균피펫은 물이 들어가면 쉽게 망가진다. 따라서 피펫팁은 균주액의 중간까지만 담근다. 멸균된 피펫팁은 한사람당 하나씩 쓰고 버린다. 피펫팁에는 균이 묻어 있기 때문에 아무데나 버리지 말고 휴지 위에 싸서 버린다. 배지에 피펫팁을 누르지말고 공중에서 균주액을 떨어뜨려야한다. 공중에서 낙하하는 균, 잡균의 오염을 막기 위해 뚜껑을 덮고 뒤집은 상태로 배양기에 넣고 배양한다. 알코올은 휘발성 때문에 은박지로 덮어둔다. 유리봉은 쓰기전은 물론 후에도 항상 에탄올로 씻고 에탄올을 묻힌 후 알코올램프의 불로 멸균을 한다. 에탄올은 유리봉에 남은 균을 멸균하고, 에탄올이 인화성이 있으므로 멸균을 더 잘 할 수 있기 때문에 유리봉에 에탄올을 꼭 적신다. 30초 동안 공기 중에서 식히는 이유는 뜨겁게 달군 상태로 배지에 도말하면 E.Coli가 죽기 때문이다. 끝난 후에도 멸균하여 남은 균을 죽인다. 배지를 흘렸을 경우에, 클린벤치에 흘렸을 경우 알콜솜으로 닦아낸다. dish 표면에 묻었을 경우 알콜솜으로 잘 닦는다. dish뚜껑과 dish사이에 들어갔을 경우 오염의 위험성이 높으므로 dish를 버린다. 바닥에 흘린 경우 알콜솜으로 닦는다. 획선평판법을 할 때 백금이에 너무 힘을 주면 배지가 반고체라서 금방 으스러지므로 배지가 꾹 눌려서 균과 구별이 불가능하다(배지의 나쁜 예가 된다.)(울룩불룩 튀어나온다. 시약을 쓰면 구분할 수 있다.)
순수배양방법에는 실험에서 사용한 도말평판법, 획선평판법 외에도 주입평판법이 있다. 주입평판법(pour plate)은 세균과 진균류의 순수배양에 널리 쓰인다. 원래의 시료를 배양접시에 부었을 때 각각 분리된 집락을 형성할 수 있도록 미생물 집단을 줄이기 위해 여러 번 희석한 시료 약간을 45℃정도로 식힌 액상한천 용액과 섞어 즉시 멸균한 배양접시에 붓는다. 한천이 굳은 다음 각각의 세포는 그 자리에 고정되어 개별 집락을 형성한다. 주입평판법은 집단의 세포 수를 확인하는데 사용될 수 있다. 전체 집락의 수는 사용된 배지에서 자랄 수 있는 시료에 들어 있는 살아있는 세포의 수와 동일하다. 표면에서 자라는 집락을 신선한 배지에 접종하여 순수배양체를 얻는데 사용할 수 있다. 십진희석법(decimal dilution)이라고도 하며 적당히 희석된 미생물 현탁액 1mL를 멸균된 petri dish에 넣는다. 그 다음 멸균한 배지를 42℃~45℃로 냉각시킨 용융상태의 한천배지 20~25mL를 가하여 잘 혼합한다. 굳혀진 한천배지를 적정시간 배양하여 한천층 내에 형성된 집락을 확인한다. 각각의 집락은 획선평판법을 이용하여 그 순도를 높인다. 불꽃으로 살균한 백금이로 미생물이 들어있는 시료에서 1백금이량(백금이로 colony 1백금이를 취할

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도말평판법,   주입평판법,   미생물,   A+