Purification of Plasmid DNA

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Purification of Plasmid DNA에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

ormation하는 방법으로 이용한다. T-vector는 이름에서 볼 수 있듯이 직선형 DNA의 양끝에 overhang(DNA가 2가닥인데 한가닥만 돌출되어있다)으로 T서열을 가지고 있다. 이렇게 양끝에 T를 넣어준 이유는 Taq polymerase(PCR용 DNA중합효소)를 이용해서 PCR을 한경우 원하는 서열 양끝쪽에 overhang으로 추가로 A 서열이 만들어지기 때문이다. 이 상태의 DNA를 연결ligation하여 변형transformation 시킨다.
pGEM-T easy vector kitT-vector은 만들기 어려워 거의 대부분 사서쓰는데 Promega의 pGEM-T vector가 그중에서 가장 널리 사용되는 것중에 하나로써 pGEM은 Promega라는 회사에서 사용하는 code명이다. 사용하기 편하며 ligation 효율도 높다.- Promega pGEM-T easy kit의 특징Rapid ligation solution을 가지고 있어서 보통 ligation하는데 16시간 정도 걸리지만 이것을 이용할 경우 1시간에서 3시간이면 반응이 끝나서 시간을 절약할 수 있어서 편하다.
plasmid 를 추출하는 일반적인 방법
기본원리 세포내에 DNA는 일반적인 double-helix를 형태를 가지는 반면 plasmid는 supercoiled형태를 가짐으로써 PH의 변화에 따라서도 plasmid의 형태 와 구조가 크게 변하지 않는 것을 이용하여 순수한 plasmid만을 추출하는 구조적 기본원리에 의한 방법이다.
방법Bacterial culture tube에 LB(일반영양배지 Luria Bertani) broth(액체배지)와 antibiotic(항생제)가 포함되어있는 곳에 재조합된 bacteria의 single colony를 picking하여 접종한 후 배양한다 bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법으로 alkaline lysis procedure을 이용한다. Plasmid DNA는 plasmid를 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될 수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다. 여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다. 다음 칼륨potassium 아세트산염acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. (reanneal : 이중나선의 핵산을 가열해서 수소결합을 끊어 단일나선으로 만들었다가 서서히 냉각시켜서 다시 수소결합을 형성시켜 이중나선의 분자를 만드는 것. - 이중나선으로의 복원을 의미한다.)covalently closed form : prokaryotes의 DNA는 대체로 이중나선이면서 circular한 form으로 이중나선 모두가 연결되어 원형을 이루면 CCC form이라 한다.)chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation(침전)으로 집중시킬 수가 있다. -구체적인 방법①solution Ⅰ: resuspension(현탁물질,부유) solution Tris-cl 은 ph를 맞추기 위한 것이고, EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. 이 과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨 지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 제거한다.② solution Ⅱ: lysis(분해) solution :SDS(sodium dodecyle sulfate), NAOHSDS는 계면 활성제로 cell을 lysis시키고, NaOH는 DNA가 세포가 깨지면서 밖으로 나왔을 때 DNA을 변성시키는 역할을 한다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게 처리한다. ③ solution Ⅲ:Neutralization solution :Na-acetateNa-acetate는 강력한 산으로 위에서 NaOH에 의해 염기성이 된 용액을 다시 중성으로 돌려 놓음으로써 DNA 를 재결합시키는 역할을 한다. pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercolied form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation이 잘되지만 chromosomal DNA는 미처 renaturation이 되지 못하고 엉기게 된다. 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거되고 상층액에 plasmid DNA가 있게 된다.
Materials
재료 : bacterial cell (형질전환 유전자를 삽입한 cell : +, 삽입하지 않은 cell : -)
시약 : solution I (50mM glucose, 25mM Tris-Cl (pH 8.0), 10mM EDTA (ph 8.0) solution II (0.2N NaOH), 1% SDS solution III (5M potassium acetate 60.0ml, glacial acetic acid 11.5ml D.W. 28.5ml) chloroform, isopropanol, 70% EtOH시약명
분자식 및 특성
solution I
glucose
대표적인 알도헥소스(탄소 6개를 가지며 알데하이드기를 가지는 단당류)이며 D-글루코스를 포도당이라 한다.
본실험에서 glucose는 cell내의 삼투압을 맞추어 주어 세포의 용혈을 막는 역할을 한다.
Tris-Cl
Tris buffer는 phosphate buffer보다도 더 많이 쓰이는 buffer로서 물에 잘 녹는다. 원래는 basic하지만 사용하려고 하는 pH를 HCl의 첨가로

키워드

Purification of Plasmid DNA,   bacteria의 plasmid,   DNA의 구조