Ex5_Western blot (Immuno blotting)

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Ex5_Western blot (Immuno blotting)에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

ody의 밑 부분은 enzyme부분이기 때문에 온도변화에 민감하다. 직접적으로 잡지 않도록 조심해야 한다. 2㎕ 딸 때는 푹 담그면 tip에 많이 묻기 때문에 살짝만 담가서 따도록 한다. 그다음 파이펫팅을 해준다. 실험 결과 우리 조는 단백질 band가 검출되지 않았다. 실험오류의 다양한 가능성을 예상해 볼 수 있지만 그 중 몇 가지만 꼽자면, 우선 protein이 여러 단편으로 쪼개졌을 가능성이다. Protein이 쪼개졌을 경우 작은 fragment로 되기 때문에 단백질 band가 관찰되지 않을 수 있다. 두 번째는 다른 여러 가지 단백질이 너무 많아서 일 수 있다. 우리는 35% AP를 넣어줬지만 나머지는 여러 다른 단백질들이 많이 섞여 있기 때문에 오류가 났을 수도 있다. 세 번째는 Alkaline Phosphatase Antibody의 nonspecific binding이다. 네번째는 정제과정에서 문제가 있었을 수도 있다. 다섯 번째는 Nitrocellulose Membrane에 문제가 있었을 수도 있다. Nitrocellulose Membrane은 재질이 hydrophilic 하다보니 protein이 membrane에 붙는 힘이 상대적으로 약하다. 또한 재질이 약해서 오래 보관하기에 취약함이 있으므로 일주일동안 보관해야하는 우리 실험에서 적합하지 않았다고 생각한다. 여섯 번째는 gel이 문제였을 가능성이다. 작은 사이즈의 단백질 쪽의 resolution이 안 좋아서 확인이 어려울 수도 있기 때문이다. 일곱 번째는 transfer가 미약하게 되었거나 너무 많이 진행이 되어 membrande에 존재하는 양이 적은 경우도 충분한 가능성이 있다. 전류를 절반을 내리고 전사시간을 길게 하면 전사 효율이 높아질 것이다. 여덟 번째는 antibody의 문제였을 수도 있다. antibody가 매우 좋은 것이 아니라면 한시간 안에 detection이 잘 될 정도로 붙지 않을 수도 있다. 아홉 번째는 reprobing한 후에 washing을 제대로 하지 않아면 antibody가 잘 안 먹었을 경우이다. 실험 오류의 원인을 제대로 분석하고 다음 실험에서 참고할 만하다.
cf. 성분
1. Primary Antibody
-제조사: sigma
-cat.no: A9549-2ML
-name: Monoclonal Anti-Alkaline Phosphatase
2. Secondary Antibody
-제조사: santa cruz Biotechnology
-cat.no: SC-2005
-name: goat anti Mouse IgG.HRP
3. Protein marker
-cat.no: EBM-1032
-제조사: ELPIS Bio
Reference
-http://bric.postech.ac.kr / 검색일 2012.05.01
- 단백질 실험 핸드북/월드사이언스/강호일/2007.03.15발행
- http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a2917?lang=en®ion=US / 검색일 2012.05.01

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Western blot,   Immuno blotning,   Blotting ,   Immuno blotting