[생화학,약대실험] 제한효소 처리 및 전기영동을 통한 plasmid DNA 확인 그리고 UV-visible spetrophotometer를 사용한 DNA의 정량분석

소개글

[생화학,약대실험] 제한효소 처리 및 전기영동을 통한 plasmid DNA 확인 그리고 UV-visible spetrophotometer를 사용한 DNA의 정량분석에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 주제

2. 실험목적

3. 실험원리(서론)
■ 제한효소
1) Type I restriction enzyme
2) Type II restriction enzyme
3) Type III restriction enzyme
■ 제한효소를 이용한 DNA의 절단
■ 전기영동 ( electrophoresis )
■ DNA 정량
(1) DNA의 농도측정 원리
(2) 분광광도계( Spectrophotometer)

4. 실험재료

5. 실험방법
■ 제한효소 처리 및 Plasmid DNA확인
■ UV-visible spectrophotometer를 이용한 Plasmid DNA의 순도분석

6. 결과

7. 토의

8. 결론

9. 참고문헌

본문내용

많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 많은 효소를 넣어주기 때문에 그다지 걱정할 필요는 없다.
2) Linear DNA의 끝부분을 자를 때는, 효소에 따라서 인식서열에 몇개의 염기가 더 붙어 있어야만 잘리는 것들이 있음을 주의한다. 이는 plasmid vector의 multiple cloning site를 두가지 효소로 자르는 경우에도 고려해야한다. 또한 PCR primer에 제한효소 인식부위를 넣어 design할 경우에도 반드시 고려해야 한다.
3) DNA의 순수도는 제한효소 처리 효율에 중요하다. DNA 용액 내에 단백질이 남아있는 경우는 보다 많은 양의 효소가 필요하다. Phenol과 같은 유기용매가 남은 경우는 제한효소에 잘리지 않는 DNA가 남는 경우가 많다.
4) 각각의 제한효소는 최적온도, 반응완충용액(reaction buffer)의 조성 및 불활성화 온도 등 각각에 알맞은 반응 조건이 있으며, 제조회사의 안내서에 이 내용이 잘 기록되어 있으므로 잘 읽어보고 사용해야 한다. 어느 회사의 제품이건 효소를 구입할 때 그 효소에 적합한 반응완충용액이 같이 지급되므로 별 어려움 없이 그대로 사용할 수 있으며 대개 10배 농축된 형태(10x)로 만들어져 있으므로 반응액을 조합할 때 10배 희석하는 형태로 반응액을 조성한다.
5) 반응 조건이 최적이 아닌 경우에는 더 많은 양의 효소를 사용해야 한다. 이는 두가지 이상의 효소로 자르는 경우 (효소들의 최적 조건이 다를 때)에 중요하다. 때에 따라서는 이런 경우에 star activity라 불리는 현상(비특이적으로 아무 곳이나 다 잘리는 현상)이 나타날 수도 있으므로 주의해야 한다.
6) 효소가 인식부위를 자르는 데에 있어서 같은 인식부위라도 주위 염기서열에 따라 그 활성도가 다를 수 있다. 그러므로, DNA 양으로 계산한 효소 양보다 조금 더 많이 넣어주는 것이 좋다. 필요할 때는 제한효소 처리 중에 조금씩 덜어 전기영동으로 monitor할 수도 있다.
■ 전기영동 ( electrophoresis )
전기영동이란 전기장 안의 전하를 띠는 입자가 양극 또는 음극으로 이동하는 현상이다. 입자의 전하량, 크기와 형태, 용액의 pH, agarose의 농도, 전류의 세기, 염기 조성 및 온도 등이 이동속도에 영향을 준다. 젤 구조가 치밀할수록 느려지며, supercoil DNA가 linear DNA보다 이동속도가 빠르다.
(1) 전기영동의 원리: DNA는 디옥시뉴클레오티드들로 구성된 중합체이다. 뉴클레오티드의 구성성분인 인산기는 음전하를 띠고 있는데 이로 인해 DNA 분자는 음전하를 띠게 된다. 따라서 매질에 이를 넣고 전극을 연결시키면 양극으로 이동한다.
(2) 전기영동의 종류: 이동계면 전기 이동법, 띠 전기 이동법, 불연속 젤 전기 이동법, 아가로스 젤 전기영동법등이 있다.
■ DNA 정량
(1) DNA의 농도측정 원리
핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 등은 자외선(260nm)을 강하게 흡수하는데, 이것은 퓨린 및 피리미딘 염기의 공명구조 때문이다. 개개의 염기들은 각기 특성적인 자외선 흡수 스펙트럼을 가지며 핵산의 총흡광도는 핵산을 구성하는 염기들의 총흡광도의 합과 같다고 생각할 수 잇기 때문에 260nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 산출할 수 있다. 한편 단백질이 강하게 흡수하는 280nm에서의 흡광도를 측정하여 Purity(순도)=A260/A280의 비를 계산함으로써 단백질에 의한 오염상태를 추정할 수 있다.
(2) 분광광도계( Spectrophotometer)
분광광도계는 시료의 흡광도를 파장의 함수로서 측정하기 위한 기기이며 일정한 파장에서 시료를 측정하거나 파장이 연속적으로 변화하여, 흡수 스펙트럼을 측정할 수 있다. 이러한 측정기기는 스펙트럼의 영역에 의하여 자외선 분광광도계 또는 적외선 분광광도계 등으로 분류된다.
참고문헌
1) 약품생화학실험, 약품생화학분과회 저, 신일북스
2) Lehninger Principles of Biochemistry, fifth edition, chapter 9, Freeman, by David L. Nelson and Michael M.Cox
3) Biotechnology, an introduction, second edition, chapter 3, Thomson Brooks/Cole, by Susan R.Barnum
4) 유전자 클로닝 입문,4판,

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