형질전환 실험_Transformation_결과레포트 [A+]

소개글

형질전환 실험_Transformation_결과레포트 [A+]에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Abstract
2. Experiment
3. Result
4. Discussion

본문내용

시간에 따른 형질전환 효율
마지막으로 competent cell의 보관 온도에 따른 형질전환 효율이다. 이번 실험에서 사용한 HIT competent cell은 -70~-80℃에서 보관해야 하며, 1/3 정도 녹은 상태에서 가장 높은 형질전환 효율을 가진다. 일정한 온도를 유지하지 못해 competent cell이 녹게 되면 형질전환 효율이 감소하기 때문에 이 영향도 있었을 것이라고 생각한다. 이러한 요인 외에도 앰피실린의 농도 등의 여러 요인이 있으므로 더 정확한 실험을 위해 모든 요인을 정확히 통제해 진행하여야 한다.
※ 앰피실린을 60℃ 이하에서 넣는 이유
- 60℃ 이상에서는 앰피실린의 화학구조가 변해 항생제의 역할을 제대로 할 수 없게 되기 때문이다.
※ Competent cell과 일반 cell의 차이점과 Competent cell을 사용하는 이유
- Competent cell은 형질전환을 위해 정상적인 세포에 물리적 또는 화학적인 처리를 해 DNA가 안으로 잘 들어갈 수 있도록 만든 세포이다. 클로닝하고자 하는 재조합 유전자를 Competent cell 안으로 삽입시키는 형질 전환 방법은 다음 2가지가 있다. 이번 실험에서는 열 충격 (Heat shock) 방법을 사용하였다.
① Chemical transformation (화학적 형질전환)
- 이는 E.coli세포를 이용한 형질전환 방법이다. 세포막은 인지질 이중층으로 되어 있으며 음전하를 띄고 있는데, 삽입하고자 하는 DNA (플라스미드 벡터)도 당인산 골격이 음전하를 띄므로 Competent cell의 세포막과 DNA는 전기적으로 서로 반발해 도입하는 것이 어렵다. 이 때 를 첨가해줌으로써 이온이 삽입하고자 하는 DNA를 둘러싸고, 따라서 전기적인 반발을 감소시킬 수 있다. 이후 42℃에서 짧은 시간 동안 열을 가해주면 세포막의 인지질 이중층이 느슨해져 양이온으로 둘러쌓인 DNA가 E.coli 세포 안으로 삽입된다. 그리고 얼음에 incubating 해 다시 세포막을 닫아준다.
② Electroporation (전기천공법)
- 이는 전기를 사용해 재조합 유전자를 삽입시키는 방법이다. 짧고 높은 전압의 전기 Pulse의 자극을 반복적으로 가해 세포막의 막전위에 변화를 줌으로써 DNA의 투과율을 높이는 방법이다. 이는 화학적 형질전환 방법보다 효율이 훨씬 좋고 정확도가 높은 형질전환 방법이다.
Fig 18. 화학적 형질전환과 전기천공법
※ 수평적 유전형질의 전달 (Horizontal gene transfer) 방식의 종류
① 형질전환 (Transformation)
- 수용자 세포가 외부의 유전물질을 받아들여 병합함으로써 그 유전정보를 발현하는 유전자의 변환이 일어나는 현상이다. 형질전환에서는 흡수능력을 가지고 있는 수용자 박테리아가 공여자 박테리아에서 빠져나온 유전 물질을 받아들이기 때문에 이 유전물질의 흡수 여부는 오로지 수용자 세포에 달려 있다. 하나의 박테리아에서 다른 박테리아로 DNA가 이동하기 위한 형질전환이 일어나기 위해서 수용자 박테리아는 일시적으로 수용가능상태로 존재해야 한다. 이러한 상태는 자연계에서는 기아나 세포밀도 같은 환경적인 변화에 의해 유도될 수도 있지만 실험실에서 인위적으로 만들어낼수도 있다. 자연적인 형질전환은 수많은 박테리아 유전자의 발현에 의존적이며, DNA를 전달하기 위한 세균의 적응 현상이라 할 수 있다. 이는 수많은 원핵생물에서 관찰되며, 전형적으로 세균의 성장 곡선에서 정체기에 들어갈 때 세포의 밀도가 높거나 영양이 결핍된 상황에서 주로 일어난다. 박테리아가 사는 곳에서 박테리아가 죽어 용해되었을 때, 염색체는 약 10~20개의 유전자로 구성된 DNA 조각으로 나뉘게 되어 주변의 환경에 노출된다. 이 조각들은 비슷한 종의 박테리아에 의해 잡히게 되어 그 박테리아는 외부 DNA 조각을 염색체에 병합함으로써 형질 전환된다.
② 접합 (Conjugation)
- 두 박테리아 세포가 직접적인 접촉을 통해 유전물질을 전달하는 방식으로, 무성생식의 이분열과 마찬가지로 새로운 생식세포를 분화하지 않고 모세포가 그대로 자신의 배우자의 성질을 띠며 행동하는 경우이다. 접하는 두 세포 중 한 세포는 유전물질을 주는 F+세포라 하고, 나머지 한 세포는 유전물질을 받는 F- 세포라고 한다. F+ 세포는 F- 세포에게 없는 플라스미드를 하나 가지는데, 이를 F 인자라 한다. 이를 가지고 있는 그람음성균은 성 섬모를 만들어 상대 세포와 접촉해 이 두 세포가 서로 접촉할 수 있는 통로를 만들어 주게된다. 대표적으로 자낭균류가 접합을 통해 유전물질을 전달한다.
③ 형질도입 (Transduction)
- 박테리오파지같은 바이러스를 이용해 숙주 박테리아로 외부의 DNA를 주입하는 방식으로, 바이러스 벡터를 통해 외부의 DNA가 다른 세포에 도입되는 경우도 형질도입이라고 한다. 형질도입에는 일반 형질도입과 특수 형질도입 총 2가지의 방식이 있다. 일반 형질도입은 박테리오파지가 감염하는 박테리아의 염색체에 들어가지 않고 파지를 복제하는 경우로, 이 경우 모든 유전자가 비슷한 확률로 형질도입된다. 그리고 특수 형질도입은 박테리오파지의 DNA가 숙주 박테리아의 DNA의 특정 부위에 들어갈 때 일어나며, 파지 DNA가 들어간 곳 주변의 유전자들이 전달된다.
※ 고체배지를 뒤집어 보관해야 하는 이유
- 배지의 성분 중에 수분이 포함되어 있기 때문에 이 수분이 증발해 물방울이 생기게 되는데, 만약 고체 배지가 아래쪽에 있으면 배지 덮개 부분에 물방울이 맺혀 고체 배지에 떨어져 생성되는 colony가 파괴될 수 있기 때문이다.
※ 10분 간 얼음에서 반응시키는 Icing을 하는 이유
- 화학물질을 처리한 competent cell은 낮은 온도에서 세포막의 유동성이 감소하기 때문에 세포막을 고르게 양이온으로 안정화시킬 수 있다. 따라서 화학물질을 처리한 competent cell은 항상 낮은 온도에서 보관해주는 것이 중요하므로 얼음에서 반응시켜주어야 한다. 또한 Icing 시간이 10분을 넘어가면 형질전환 효율이 급격하게 떨어지므로(Fig 17.) 10분 이하로 얼음에서 반응시켜주어야 한다.

키워드

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