생물화학공학이론및 실험_ Miniprep_PCR_Restriction_Transformation_Liquid culture_Enzyme activity 전 실험 과정 통합 실험 과정_ 결과레포트 [A+]

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생물화학공학이론및 실험_ Miniprep_PCR_Restriction_Transformation_Liquid culture_Enzyme activity 전 실험 과정 통합 실험 과정_ 결과레포트 [A+]에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Abstract
2. Experiment
3. Result
4. Discussion
5. Reference
[1] 김명원 외 9명, 생명과학 개념과 현상의 이해, PEARSON , page 186,210~212

본문내용

로 하였다.
Fig 13. 용액 1ml를 샘플링해 UV-Vis spectrophotometer로 측정한 흡광도
(4) 두 개의 bottle을 shaking incubator에서 40 ℃, 150rpm으로 반응시킨다.
(5) 10분, 20분, 30분, 40분 총 4번 흡광도를 측정하여 측정한 data를 바탕으로 Abs 405nm/min의 그래프를 그리고, 아래의 식을 이용하여 효소의 specific activity (U/mgenzyme )를 계산한다.
※ 실험 시 유의사항
- pNPB는 광분해될 수 있으므로 호일로 감싸야 한다.
- 흡광도 측정할 때 UV-Vis spectrophotometer에 외부 빛이 들어가지 않도록 한다.
- Sampling할 때 정확한 흡광도 측정을 위해 cuvette에 지문이 묻지 않도록 주의한다.
- 측정한 흡광도가 1이 넘으면 시료를 희석하여 실험을 진행해야 한다.
3. Result
실험의 결과 각 시간에 따라 UV-Vis spectrophotometer로 측정한 p-NPB의 흡광도 값은 다음 Table 1. 과 같다. 실험의 초기값은 1min으로, calB 효소를 넣고 1분 뒤에 흡광도를 측정하였다. 또한 실험의 대조군은 0.5 mM pNPB 용액에 calB 효소를 넣지 않은 용액이며 대조군의 흡광도는 따로 측정하지 않고 실험군의 시간에 따른 흡광도를 측정할 때 영점을 수정하기 위해 사용하였다.
시간 (min)
흡광도
(Abs 405nm/min)
1
0.010
10
-0.098
20
0.064
30
0.117
40
0.143
Table 1. 시간에 따른 흡광도의 변화 (1min는 초기값)
실험의 결과 10min에 측정한 모든 조의 흡광도가 (-)값이 나왔다. 이는 UV-Vis spectrophotometer의 영점을 잘못 설정해 나온 잘못된 값이었기 때문에 10min의 흡광도를 제외한 나머지 시간에 따른 흡광도 값을 그래프로 도식화하였다.
Fig 14. 시간에 따른 흡광도 변화 그래프
Lambert-Beer 법칙을 이용하여 pNPB의 가수분해의 결과로 생성된 생성물 p-Nitrophenol의 농도를 계산하려면 다음과 같은 공식이 필요하다. 공식의 는 기준 영점으로 설정한 대조군과 실험군의 농도 차이인데, 대조군의 흡광도는 시간별로 측정할 때마다 샘플을 따서 영점을 수정하는 데에 사용하였으므로 와 같다고 볼 수 있다. 따라서 이 값에 따른 pNPB 용액의 농도를 계산해보자. 이 과정 역시 영점 설정의 오류가 있는 10min의 실험 결과를 제외하고 나머지 시간에서의 흡광도와 농도를 계산하였다.
1min :
20min :
30min :
40min :
시간 (min)
흡광도
(Abs 405nm/min)
농도 (mM)
1
0.010
0.0005405
20
0.064
0.003459
30
0.117
0.006324
40
0.143
0.007730
Table 2. 시간에 따른 흡광도 변화와 pNPB 용액의 농도
이제 마지막으로 각 시간에서의 효소의 활성도를 구하기 위해 다음 Lambert-beer 공식을 이용할 수 있다. 여기에서 용액의 부피는 54.45 ml의 50mM Tris-HCl buffer + 0.55ml의 50 mM pNPB + 20 μL calB를 모두 더해주어 총 54.45+0.55+0.02=55.02ml 이다. 흡광도의 측정 후 큐벳의 용액을 다시 bottle 안으로 넣어주었기 때문에 모든 시간에서의 용액의 부피는 일정하다. 또한 원래 Specific activity는 효소 활성을 효소의 질량으로 나눠주어야 하지만 이번 실험의 경우, 효소의 질량을 모르기 때문에 효소의 활성만을 구해주었다.
시간 (min)
농도 (mM)
효소활성 ()
1
0.0005405
0.0297
20
0.003459
0.00952
30
0.006324
0.0116
40
0.007730
0.01063
Table 3. 시간에 따른 pNPB 용액의 농도와 효소 활성
1min :
20min :
30min :
40min :
이는 500배 희석한 calB 효소의 활성도이기 때문에 희석 전 원래의 calB 효소의 활성을 구하려면 이 값에 500을 곱한 효소 활성을 가진다고 생각할 수 있다.
4. Discussion
제조한 pNPB 용액은 시간이 지남에 따라 흡광도가 증가하였고, 이에 따라 농도 또한 증가하였다. calB 효소를 넣기 전 pNPB 용액은 투명한 색을 유지하고 있었지만, calB 효소를 넣어주자 노란색으로 변화하였다. 이는 calB 효소에 의해 pNPB가 p-Nitrophenol로 가수분해되었기 때문이며, 이러한 색의 변화를 통해 calB 효소가 정상적으로 활성되고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한 효소의 분석법 중 분광광도법과 Lambert-Beer 법칙을 이용해 효소의 농도와 활성을 계산할 수 있었다. 효소의 활성은 효소에 의해 일어나는 촉매작용으로, 효소 1분자에 대해 1분 동안 변화한 기질의 분자 수로 표현할 수 있다. 이번 실험에서의 40min 에서의 효소 활성은 가 나왔는데, 이를 희석 전 calB 효소의 활성으로 계산해보면 이다. 이렇게 나온 효소활성 5.315U는 효소 1 분자에 대해 약 의 기질 p-NPB가 변화한다는 것을 알 수 있다.
p-NPB 용액에 calB 효소를 넣어준 뒤 1분, 10분, 20분, 30분, 40분이 지난 뒤 각각의 흡광도를 측정하고 영점 설정의 실수로 잘못 나온 10분의 흡광도를 제외하고 나머지 시간에서의 시간에 따른 흡광도의 변화를 그래프로 도식화하였다. 이 그래프인 Fig 14. 로부터 시간에 따른 흡광도 변화 그래프는 을 가지는 거의 선형 형태를 가짐을 알 수 있다. 그러나 40분보다 더 시간이 지나서도 계속해서 흡광도를 측정한다면, 흡광도는 선형으로 계속해서 증가하는 것이 아니라 점점 특정값에 수렴하는 다음 FIg 15. 와 같은 형태를 보일 것이다. 왜냐하면 이번 실험에서 넣어준 calB 효소의 양은 20로 제한되어 있으며, 기질인 pNPB의 양 또한 제한되어 정해진 양이기 때문이다.
Fig 15. 시간이 더 흐른 뒤에 예상되는 시간에 따른 흡광도 변화 그래프의 개형

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생물화학공학,   화학공학,   화학공학실험,   생물실험,   Miniprep,   PCR,   Restriction,   Transformation,   Liquid culture