꿀벌의 백묵병 원인균 Ascosphaera.apis의 18s ribosomal RNA의 cloning 및 Expression

소개글

꿀벌의 백묵병 원인균 Ascosphaera.apis의 18s ribosomal RNA의 cloning 및 Expression에 대한 보고서 자료입니다.

목차

논문개요

제 1장 서론
제 1절 연구배경
1.백묵병
제 2 절 연구목적
1. Ascpocphaera apis 18S rRNA gene

제 2 장 실험재료 및 방법
제 1 절 실험재료
1. 클로닝을 위한 균주와 플라스미드 vecter
1) DH5α
2) pBX vecter
. 2. 세균배양 배지(윤병수, 1999; Sambrook et al., 1989
1) 액체 배지의 제조
2) 고형 배지의 제조
3) 항생제 배지 제조
3. 재조합 DNA 관련 효소 및 시약
1) 1×TAE agarose gel
2) Ethidium Bromide(EtBr 1.0㎍/㎖
3) 50×TAE(Tris-phsphate) buffer
4) Solution I
5) Solution II
6) CaCl2 100 mM solution
7) 7.5M Ammonium acetate solution
8) 75% Ethanol
9) Tris/Cl buffer
제 2 절 실험방법
1. plasmid isolation(Ammonium acetate 법
2. DNA Restriction (Vector 제작
3. pS44 DNA restriction
4. Electrophoresis
5. PCR (polymerase chain reaction
6. Elution ;Gene clean kitⅢ(Bio101
7. Ligation
8. Competent cell 제조 (DH5α) - CaCl2 법 사용
9. Transformation (Heat shock
10. screening

본문내용

해서는 균주와 YENB배지의 비가 1 : 24가 되도록 하기 위해 균주를 1㎖ 첨가하고 살짝 부유시킨 후, shaking incubator(180rpm, 37 )에 3시간 culture했다. 계대배양한 균을 ice에 5분간 정치 시키고 1.5㎖균액을 1.5㎖ E-tube에 옮기고 8000rpm으로 1분 원심분리하여 상등액을 완전히 제거한 후, ice에 정치했다. 1㎖ ice-cold 100mM CaCl₂에 조심스럽게 cell을 suspension시키고 다시 ice에 20분간 정치했다. 원심분리 6000rpm 2분으로 cell을 가라앉힌 후 상등액을 제거하고, 1㎖ ice-cold 100mM CaCl₂에 조심스럽게 cell을 suspension시키고 다시 ice에 20분간 하는 실험을 반복한다. 침전된 세포를 200㎕ ice-cold 100mM CaCl₂에 조심스럽게 부유한 후 overnight을 했다. 보관은 최종 농도 15% 이상의 glycerol을 넣고 세포액과 glycerine을 잘 섞어 준 후, -70 냉동 보관했다.
,9. Transformation (Heat shock)
-70 보관된 c-cell을 ice box에서 30분 해동시키고 ligation solution 5㎕를 200㎕
c-cells에서 mix 했다. ice 30분 정치 후, heat shock 42 water bath 50초간 정치하고, ice에서 2분후에 YENB배지 800㎕ 첨가하여 mix 하여 37 1시간동안
shaking incubation한다. 준비한 Ap plate에 균 액 200㎕, 400㎕를 넣어 도말한 후,
37 incubator에 over night 했다.
10. screening
colony를 확인하고 picking할 colony를 선별한다. autoclave된 이쑤시개로 다른 Ap
plate에 picking하고 액체배지가 든 test-tube에 배지와 이쑤시개의 끝부분이 닿도록
문지른다. plate는 incubator에, test-tube는 shaking incubator에 넣어 O/N culture시킨다. 다음, 원하는 DNA를 isolation하고 37 1hr로 restriction하고 1% agarose gel에서 전기영동한 뒤 cloning 여부를 확인하였다.
Table 18. Composition of recombinant DNA Restriction
Solution Volume
clone DNA 5㎕
EcoRⅠ 1㎕
RNase 0.5㎕
Restriction buffer(10 Y+/Tango) 2㎕
D.W 11.5㎕
Total 20㎕
제 3 장 결과 및 고찰
제 1 절 E.coli에서의 Ascpocphaera apis 18S rRNA gene의 cloning
1. Ascpocphaera apis 18S rRNA gene의 PCR 및 TA cloning
Figure.3 vecter, insert 전기영동 사진
M : Marker, Lane1, 2 : pBX (2.9Kb + 500bp),Lane
3, 4 : Insert DNA (900bp)
1) 900bp의 Insert DNA를 증폭한다.
2) 증폭시킨 Insert DNA를 가지고 준비된 vecter에 Ligation한다.
-LLigation mix
pBX : 1ul, 1ul, 2ul
PCR : 3ul, 9ul, 9ul
T4 DNA Ligase : 1ul (1unit)
10x T4 DNA Ligase buffer : 2ul
D.W: 13ul, 7ul, 6ul
3) ligation된 vecter + insert DNA를 준비된 C-Cell에 transformation한다.
- 균주 : DH5a,
- 온도 : 42
- 시간 : 40sec
4) AP Plate에 spreading
5) Screening
Figure 4. Restriction analysis of clone(BamHI, SacI)
Lane M : Marker, Lane 1 : vecter(2.9kb), Lane 2 : Insert(900bp), Lane
3 , 4 : Clone(B,H)
-Clone의 screening 과정에서 vector내에 존재하는 restriction enzyme site(BamHI, SacI)가 존재하므로 삽입된 insert보다 50bp가 더해진다. (insert보다 약간위 쪽에 위치하는 것으로 확인 가능)
제 4 장 결 론
900bp의 진핵생물의 유전자를 원핵생물의 DNA안으로 집어넣고 원핵생물이 클로닝을 시킬 수 있는가를 보았다, 원핵생물들의 재조합 발현은 여러번의 시행착오를 겪었지만 클로닝에 성공하였다.
우리의 현대의 연구과제들은 작은 원핵생물의 연구가 아닌 휴먼 게놈프로젝트를 위한 중요한 연구문제에 직면하고 있다. 하지만 인간의 DNA는 상당히 목잡하고 어렵기 때문에 염기서열이 비교적 단순한 박테리아를 사용하고 있다. 게놈프로젝트의 중요성은 그 연구의 규모에 있어서 그 중요성을 말해주고 있다.
본 실험은 같은 길에 서있는 본인이 현 시대흐름에 함께 나아가기 위한 시작점에서 시작한 일보의 시작으로서의 단계이다.
실험과정에서 Ligation 비율이나 시간, transformation 시간이나 온도가 매우 중요하지만 실험자의 마인드와 세심함도 실험에 있어서 매우 큰 비중을 차지했다.
참고문헌 및 참고 인터넷사이트
1. 윤병수 (1999) 분자생물학 연구방법론II. 경기대학교
2.. 분자생물학노트 3판. 1998. 대표저자 이대실 외 22명 저. Kist 생명공학연구소 발 행.(일반적 실험법)
3. 유전자 크로닝 입문 제 3 판. 대표저자 강종백 외 2명 저, 월드 사이언스
4. Morelle, G. (1988) Aplasmide extraction procedure on miniprepscale. Focus
11, 7.
5. http://www.progma.com
6. http://www.medkem.gu.se/cutter/
7. http://soback.kornet21.net/~drmicro/
8. http://www.cgcsci.com
9. http://wwwhytti.uku.fi/∼oikari/

키워드

유전학,   분자생물학,   RNA,   클로닝,   gene,   생물학,   생물공학