Ligation of DNA(예비&결과레포트)

소개글

Ligation of DNA(예비&결과레포트)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

예비(1) 실험 제목
(2) 실험 목적
(3) 실험 원리
(4) 실험 방법
(5) 실험 재료
(6) 참고 문헌

결과(1) 실험 제목
(2) 실험 목적
(3) 실험 내용
(4) 실험 결과
(5) 토의 및 고찰

본문내용

sphodiester결합을 촉진키는 기능을 하는 ligase를 이용하여 DNA상의 nick을 공유결합적으로 연결한다.
(3) 실험 원리
① Ligation : DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정을 가리키는 용어이다. 이 반응에 이용되는 효소를 ligase라 하며 DNA를 기질로 사용 하는 ligase를 DNA ligase, RNA를 기질로 사용하는 ligase를 RNA ligase라 한다.
①-1 Ligase (DNA ligase) : 세포내 이중가닥 DNA 분자 중에서 단일가닥된 불연속을 고치는 효소. 정제된 DNA ligase는 유전자 클로닝 작업에서 DNA분자들을 서로 연결시키는데 사용된다.
①-2 ligation 실험에서 중요한 요소 : 반응액에서 DNA분자의 end 농도이며 이는 ligase의 기질로 작용하기 때문이다.
② 제한효소로 절단된 부위 붙이는 방법: Ligase가 DNA를 붙인다고 하는 것은 DNA 끊어진 부분 즉 5\'Phosphate와 3\'OH를 연결하는 것을 말한다. Blunt end의 경우 조건을 약간 달리하면(낮은 온도, 높은 효소농도, 오랜 시간) 붙일 수 있지만 Overhanging된 단일가닥의 DNA가 Cohesive(Sticky)가 아닌 경우, 즉 예를 들어 서로 다른 효소 등으로 잘려 염기간의 상보적 결합이 없는 OVerhanging구조를 보이는 경우, Ligase가 작용할 가능성은 거의 없다. Ligase가 작용하기 위해서는 위에서 말한 끊어진 두 가닥의 5\'말단과 3\'말단이 만나야 하는데 Cohesive end의 경우라면 쉽게 만나겠고 Blunt end의 경우 어렵지만 가능성이 있겠지만 전혀 다른 Overhannging구조라면 만날 가능성이 거의 없다고 봐야 할 것이다. 그래도 꼭 붙여야 한다면 다음 두가지 응용을 생각해 볼 수 있다. 먼저 DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment를 이용하는 것이다. 이것을 이용하면 overhanging구조의 gap이 채워진다. 즉 Blunt end가 되는 것이다. 그런 후 위에 언급한 Blunt end ligation을 하면 된다.
다음으로 LInker를 만드는 것이다. 예를 들어 A,B의 제한효소가 사용되는 경우 A,B가 잘려진 형태의 DNA를 합성한다. 한쪽 가닥씩 합성해서 나중에 annealing하면 된다. 그러면 그 Linker는 두 제한효소의 sticky end를 갖게 되고 일반적인 Ligation으로 쉽게 붙일 수 있다.(이 때 linker끼리 붙지 않기 위해 CIAP처리를 한다.)
②-1 Blunt end & Cohesive-end : 양 가닥 말단이 동일한 뉴클레오타이드 수를 가지며 말단에 단일 가닥이 더해지지 않은 DNA분자. cohesive end를 가지고 있지 않은 경우 ligation은 보다 복잡하고 상당히 천천히 반응이 일어난다. Cohesive-end ligation은 blunt-end ligation에 비해 100배 빨리 진행된다. 이 이유는 blunt-end fragment는 anneal할 수 없기

키워드

ligation,   dna,   ligation of dna,   ligase,   phosphodiester,   리게이션