아미노산 적정

소개글

아미노산 적정에 대한 보고서 자료입니다.

목차

■ Amino Acid Titration

■ SDS-PAGE

■ The Preparation of Genomic DNA & Plasmid DNA from Bacteria

■ Bacterial Transformation

■ Physical Properties of DNA

■ Southern Blotting

■ Carbohydrate 정성분석

본문내용

nce의 변화를 관찰하게 된다.
어떤 특정한 DNA의 melting Transition 을 나타내는 Parameter로써 Tm Value를 쓰는데 이는 A260 의 값이 Maximum A260 에 대해 절반을 나타내는 온도이며 이를 Melting Temperature라고 한다.
즉 Melting Temperature는 상이한 두 DNA의 Thermal Stability 를 비교할 수 있는 Parameter로써 그 의의가 있다.
나. Double-Helix DNA의 Stability에 영향을 미치는 Factor들
(1) G.C Content Ration
DNA의 Pyrimidine Base 와 Purine Base 의 Ration는 Double-Helix를 이루고 있는 DNA의 특성에 의해 동일하다. 즉 [A] = [T], [G] = [C] Ratio는 항상 일정하다. 그러나 전체 Base Pair중 G,C Pair의 Fraction은 아주 다양한 분포를 보이고 있다.
어떤 특정한 생물의 DNA Composition을 나타내는 방법은,
([G] + [C]) / [All Base], 즉 전체 Base Pair중에서 [G], [C] pair의 비율로 나타낼 수 있다.
이러한 G,C Content Ration는 DNA의 Physical Property에 큰 영향을 미친다. 대표적인 것이 Heat에 의한 Denaturation에서의 Melting Temperature에의 영향이다.
즉 G-C Base Pair는 A-T Base Pair에 비해 3개의 Hydrogen bond Pair를 가지고 있으므로 DNA의 Double-Helix 경향을 더욱 강화시켜 준다. 따라서 [G], [C] pair의 비율이 높은 DNA Double Strand의 경우에는 Melting Temperature가 더 높을 것이다. 이는 그림 2 에 잘 나타나 있다.
(2) Hydrogen bond formation에 관한 다른 실험
DNA의 Double-Strand Structure를 Stabilize 하는 Factor들에 대한 연구는 앞에서 설명한 Denaturation Experiment에 의해 이루어졌다. 즉 G+C Content나 여러가지 실험조건에 따른 Tm Value의 변화를 관측함으로써 어떠한 Factor가 Double-Helix를 형성하는데 영향을 미치는지 알수 있다.
G+C Content외에도 Hydrogen Bonding에 의한 Base-Pairing이 DNA Stabilizing에 영함을 끼친다는 것은 Base Pair 와 직접 Base Pair를 형성할 수 있는 물질인 Urea나 Formaldehyde 등을 첨가하여 Melting Curve를 관찰함으로써 다시 확인될 수 있다. Urea 나 formaldehyde등은 Single Stranded DNA의 Base와 Hydrogen Bonding을 행함으로써 Single-Strand DNA를 Stabilize시켜줌으로써 Tm Value를 찾준다.
(3) Hydrophobic Interation
Weak Soluble Substance와 Water간의 Interation을 증가시키는 물질은 Hydrophobic Interation을 감소시킴으로써 Double-Helix 구조를 Destabilization 시킬 것이다. 이러한 것은 Sodium Trifluoracetate의 농도를 증가시킴에 따라 Tm Value가 감소된다는 실험적 사실에 의해 실증되었다. 즉 Nonsoluble한 Base와 Interation하여 Solubility를 높여주는 Sodium Trifluoracetate는 Single-Stranded DNA의 Stability를 높여준다.
(4) Ionic Interation
DNA의 Backbone에는 Negative Charge를 띄고 있는 Phosphate가 존재한다. 이러한 Phosphate의 Negative Charge는 이들이 Double-Strand를 형성할 때 Repulsion을 일으켜서 Double-Stranded DNA를 불안정시킬 것이다. 이는 NaCl와 같은 염을 첨가하여 Negative Charge를 Neutralize시키면 Tm Value가 증가한다는 사실로부터 알수 있다.
이와 같은 성질을 이용하여 Renaturation 실험에서는 High-Salt Condition을 만들어 준다는 것을 알수 잇다.
(5) pH Dependency (Denaturation of DNA in Alkali)
높은 pH에서 DNA의 Base의 proton이 Deprotonated되면서 Double-Helix Structure가 Destabilize된다. 11.3 이상의 pH에서는 DNA Base의 모든 Proton이 Deprotonated되므로 Double-Helix DNA를 형성할 수 없게 된다.
다. Renaturation and C0t Value
Denaturation 된 DNA는 특정한 Condition에서 native DNA로 다시 형성된다. 즉 Single-Strand DNA가 Double-Stranded DNA로 다시 Annealing 되는 과정을 Renaturation 이라 한다.
Renaturation 에의 조건을 간단히 요약하면 다음과 같다.
① Salt Condition은 높아야 한다. 즉 Negatively Charged Phosphate 끼리의 Repulsion을 제거하기 위해서는 보통 0.15 - 0.50 M 의 NaCl이 사용된다.
② Temperature는 Random Intrastrand Hydrogen Bond를 Elimination 하기 위해서 어느 정도 높아야 하지만, 너무 높아서는 안된다. (Double-Strand를 Broke하기 때문이다) 최적의 온도는 20 - 25 °C 정도이다.
시간과 DNA 농도, 그리고 Renaturation 에 관한 연구로부터 우리는 DNA Sequence에 대한 여러가지 성질을 유추해 낼 수 있다.
일반적으로 DNA의 Renaturation은 Cooperative하다. 즉 Random Collision 에 의해 DNA의 Single Strand가 부

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