[생화학 실험] Purification of Thermostable DNA polymerase / 열에 안정한 DNA 중합효소의 정제

목차

1. 실험제목

2. 실험일자

3. 제출자

4. 목적

5. 원리

6. 시약 및 기자재

7. 결과

8. 고찰

9. 참고문헌

본문내용

50mM KCl이 포함된 bufferC로 평형을 맞추어 준 후, sample을 loading 한다. Biorex 70은 (-)charge를 띄는 물질로, DNA에 binding하고 있는 Taq pol이 일부 (+) 전하를 띄고 있다는 점에 착안하여 Biorex 70를 포함하는 ion exchange chromatography를 실행하여 DNA에 붙은 Taq pol을 순수하게 분리해낼 수 있다. sample에 loading 한 후, washing과정을 거쳐 elution하여 Taq pol이 포함된 용액을 받아낸다.
실험결과, 우리조의 cell sample에는 100ug 중 8ug의 Taq pol이 들어있었으며, 처음 3day 실험과정에서 pellet에 buffer 5ml을 넣은, 총부피 5ml중에서 16ul을 loading 하였으므로, 희석배수는 16ul/5000ul=1/300이고, 우리가 얻은 총 protein의 양은 100ug*300=30000ug이라고 할 수 있다. 이와 같은 방식으로 각 sample의 실제 양을 구하고, 전단계의 protein의 양 중에서 얼마만큼의 protein이 다음 단계에서 뽑혔는지(yield)를 구하고, 각 sample의 전체 protein 중에 우리가 원하는 단백질이 얼마나 뽑혔는지 그 비율(purity)을 구하고 전 단계에 대한 비율(fold)을 구해보았다.
결과를 보면, cell -> lysate sup -> column input sample -> total elution 으로 갈수록 yield의 값은 점차 낮아지고, fold의 값은 점차 높아짐을 알 수 있다. 이것은 점차 정제를 해나가기 때문에 필요없는 protein은 flow-through나 washing으로 흘려보내고 우리가 필요한 protein만을 취득하기 때문이다. 우리조의 경우, total elution의 fold는 cell 용액과 비교하였을 때, 12.25로 fold가 높은 편이었다. yield는 조금 낮은데 그 원인으로는, undesired protein을 denaturation 시키는 75℃ incubation에서 2조 분께서 우리조의 sample을 쏟으시는 바람에 sup sample에 실제 5ml이 아니라 4ml 정도로 취득이 되었다. (그래서 sup sample에 1ml의 buffer B를 채워 넣었다. 그러므로 희석배수는 변하지 않는다.) 1ml의 loss는 꽤 클 것이라고 예상된다. 왜냐하면 만약에 loss가 없었다고 가정하고 용액에 target protein이 균일하게 존재한다고 가정한다면, total protein과 target protein의 양은 지금의 결과에 20%가 더해져야 하기 때문이다. 즉, sup의 경우, 12*1.2=14.4ug이 실험값으로 나왔을 것이고, 여기에 희석배수 300을 곱해주면 4320ug이 되며, total elution의 값도 20%증가한 138.6ug이 될 것이다. 이 값으로 cell 용액에 대한 total elution의 yield를 구해보면, 138.6/30000*100=0.462% 로 yield가 증가하였음을 알 수 있다.
그밖에도 실험과정 상에서 pipette을 조작하는 과정, 특히 거품이 생기는 것,에서 정교하지 못하게 실험을 했던 것이 yield를 줄이는 큰 원인이었던 것 같다.
Reference
-학부생화학실험(2) 후반부 교재
-http://en.wikipedia.org/wiki/Aziridine
-http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_purification
-http://blog.naver.com/hgsaem?Redirect=Log&logNo=150005363105

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DNA 중합효소,   purification,   정제,   DNA polymerase,   생화학 실험,   생물 실험,   실험 보고서,   실험레포트