siRNA란 무엇인가

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저렴할 뿐 아니라 단시간 내에 siRNA를 제조할 수 있다는 장 점이 있다 . 그러나 이 방법 역시 siRNA가 세포 내로 도입된 지 2-3일 후면 RNAi위 효과가 감소하여 transient assay에만 사용할 수 있다는 단점이 있다. GEP발현이 in vitro에서 제조된 siRNA도입에 의히 1-2일 동안 효과적으로 저해된다는 사실도 있다.
(3)in vitro transcription에 의해 합성된 long dsTMA의 Rnase III family enzyme을 이용한 절단
위에서 이미 언급한 바와 같이 하등생명체를 대상으로 할 때는 long dsRNA를 직접 주 입해도 RNAi 현상을 효과적으로 유도할 수 있지만,포유동물세포를 대상으로 하면 PKR활성화에 따른 비특이적 단백질합성 저해가 유발되어, 필히 도입하기 전에 인터페 론 발현을 유도하지 못하는 작은 크기의 siRNA로 절단하여야 한다. 이를 위하여 실제 세포 내에서 long dsRNA를 siRNA로 processing 하는 효소인 RNase III를 이요하여 다 양한 염기서열을 갖는 siRNA를 생산하는 방법이다. 이방법은 기존의 in vitro transcription kit와 동일한 방법으로 비교적 긴 sense 및 anti-sense RNA를 합성하여 annealing시킨 뒤,RNase III를 반응시켜 시험관 내에서 siRNA 가 만들어져 한 종류의 siRNA 만으로 유전자 발현을 억제하려는 시도 보다는 보다 높은 확률로 gene silencing를 유도할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 이방법 역시 위에서 언급한 다른 방 법과 마찬 가지로 일시적인 유전자발현 억제만을 유도할 수 있으며, 또 하나의 내포된 문제점은 다양한 heterogenous siRNA의 사용으로 인한 non-specific gene silencing 의 가능성이 존재한다는 점이다.
(4)siRNA expression plasmid나 viral vector 의 세포 내 전달을 통한 발현
위에서 언급한 방법들은 모두 transient gene silencing에 의한 effect가 수 일 이후 에 나타나는 경우에는 사용에 제한이 따른다. 이러한 문제점을 해결하는 방법으로 siRNA 를 장기간 동안 세포 내에서 발현 시킬 수 있는 벡터시스템이 개발되기 시작하였다. 이 를 위한 벡터의 디자인은 대부분 짧은 RNA transcript를 전사하는 RNA polymerase III promoter를 이용하는데 이들 promoter로부터 siRNA target sequence의 sense 및 anti sense sequence가 적당한 개수의 loop를 사이에 두고 위치하며 발현되어 small hairpin 구조의 RNA가 합성되게 된다. 이렇게 합성된 shRNA는 세포내에 존재하는 siRNA processing enzyme에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 target gene 의 sillencing을 유도하게 된다. 현재 이러한 pol III promoter로부터 shRNA를 발현시 키는 벡터시스템으로는 아래와 같은 4가지 시스템이 보고되어 있다.
(4-1) shRNA expression plansmid vector
transfection에 의해 세포 내로 도입되어 shRNA를 발현하는 시스템으로 transient assay뿐 아니라 antibiotic resistant marker 의 도입으로, stable cell line 구축을 통해 long-term assay도 가능하다. 그러나 대상 세포에 따라 transfection efficiency의 비효율성과 stable clone에서의 shRNA발현 저하 등이 문제점으로 지적되고 있다. 현재 이러한 shRNA expressing plasmid vector
시스템은 Ambion을 비롯한 몇몇 외국업체와 국내 벤처기업인 벡터코어에이를 통해 구입 및 custom service를 받을 수 있다.
(4-2) shRNA expession adenovirus vector
광범위한 세포주에 비교적 높은 효율로 transduction이 가능하다라는 장점을 가 지고 있는 바이러스벡터로 shRNA의 발현을 일주일 이상 지속 시킬 수 있지만 stable clone은 만들 수 없다. 재조합 아데노바이러스를 제조하는데 상당한 경험 과 시간이 필요하며 high-titer의 바이러스를 감염시키면 세포독성이 나타난다는 단점을 가지고 있다 .또한 강한 면역성을 나타내기 때문에 동물모델을 이용한 실 험에서 반복주입이 불가능 하다는 문제점도 가지고 있다.
(4-3) shRNA expression retrovirus vector
면역성과 독성을 나타내지 않으며 비교적 간단하게 shRNA 를 발현하는 stable cell line을 구축할 수 있는 바이러스 벡터시스템이다. 그러나 primary cell, lymphocyte cell line, 그리고 몇몇 세포주에서는 비교적 낮은 transduction dfficiendy를 나타내며, 더군다나 non-dividing cell에서 유전자 전달이 불가능 하다는 단점이 있다.
(4-4) shRNA expression lentivirus vector
위에서 언급한 shRNA발현벡터들의 장점을 모두 가지고 있으며 단점들을 해결할 수 있는 벡터시스템으로 pimary cell 및 non-dividing cell을 비롯한 광범위한 세 포로 transduction efficiency가 매우 높으며, 특히 동물모델에도 효율적인 적용 이 가능하다. 면역성 및 독성을 유발하지 않고 높은 감염효율을 바탕으로 transient assay도 다양한 세포 주에서 수행할 수 있게 하며, shRNA를 장기간 발현하는 stable cell line의 구축도 쉽게 진행할 수 있다. 벡터코어에이에서 custom service를 통해 shRNA발현 렌티바이러스를 제조하여 실험에 사용할 수 있다.
(5)PCR-derived siRNA expression cassette의 세포 내 전달을 통한 발현
위에서 언급한 siRNA제조 방법들은 target gene의 silencing을 가장 효과적으로

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siRNA,   유전자,   miRNA,   RNAi