[실험] General PCR & 전기영동 & 플라스미드 & 제한효소 & 형질전환, General PCR

소개글

[실험] General PCR & 전기영동 & 플라스미드 & 제한효소 & 형질전환, General PCR에 대한 보고서 자료입니다.

목차

Subject : General PCR
Introduction : PCR

(a) Denaturation
(b) Annealing
(c) Extension

Method

Result



Subject Preparation of chromosomal DNA
Introduction : 전기영동

1.전기영동...
2. 전하에 미치는 pH의 영향
3. 전기영동의 기법

Method



Subject Small-scale Preparations of Plasmid DNA
Introduction : 플라스미드


DNA 클로닝: 공여체 DNA를 다량 복제하는 것
DNA 재조합 과정

Material


Subject Enzyme treatment
Introduction : 제한효소

Method
Result



Subject Ligation and Transformation
Introduction : transformation -형질전환

Transformation 과정-
형질전환동물-
◆ 형질전환 동물의 이용

Method
Result

본문내용

며 pH가 감소할수록 순 양전하는 증가하고, 전기영동에서 단백질의 이동이 증가된다. 등전점보다 높은 pH에서는 단백질은 순 음전하를 가지게 되며 pH를 높임에 따라 이동도도 증가할 것이다. 그러나 이 경우 방향은 반대가 된다. 분자 전하에 대한 pH의 효과는 이온 교환에서와 같이 전기영동에 있어서도 중요하다. 이와 같은 현상은 산과 염기들에서도 나타나는데, 차이점은 pH의 변화에 따라 전하의 극성은 변하지 않고 단지 전하의 크기만 변한다는 점이다. 예를 들면, pI보다 상당히 낮은 pH(적어도 pH 단위로 2이하)에서 산은 본질적으로 이온화 형태로 존재하므로 전기영동에 기여하지 못하게 된다. 아울러 실제에 있어서는 전기 영동적 이동도와 전하 사이의 상호 관계는 더욱 복잡하게 나타난다. 하지만 pI의 개념은 효과적으로 이용할 수 있다.
3. 전기영동의 기법
전기영동은 매우 광범위한 분석(analytical)과 조제(preparative)기법의 기초를 제공한다. 이들 중 대부분의 경우는 전기영동적 이동도의 차이특성과 다른 분리적 메커니즘들을 결합하여 \'혼합 기법(hybrid techniques)\'으로 이용되고 있다.
이동 계면 전기영동 ,셀룰로오스-아세테이트 전기영동 ,아가로즈 겔 전기영동 ,원판 전기영동 ,면역 전기영동 등의 종류가 있으며,,,이 중에서,,
-->아가로즈 겔 전기영동을 살펴보면~!
아가로즈(agarose)는 갈락토스(galactose)와 겔리듐 아만시 (Gelidium amansii)의 한천(aga -r)으로부터 유도된 3,6- 안하이드로칼락토스 단위체들 (anhydrogalactose units)로 구성되는 천연의 다당류이다. 겔은 전분 겔과 유사한 방법으로 끓는 물에 건조한 중합체를 넣고 상온 에서 식힘으로써 얻어진다. 전분 겔보다 다공성 구조이며 적절한 강도를 가진다. 아가로즈 겔(agarose gel)에서의 전기영동은보다 진정한 의미 의 전기영동으로써 하전된 분자들은 전기장의 영향에 의해 이동하나 지지 물질에 의해 저지되지 않는다. 아가로즈 겔을 이용한 전기영동은 가장 큰 거대 분자와 그 복합체인 바이러스, 효소 복합체, 지질단백질(lipoprotein), 핵산(nucleic acid)등의 전기영동에 이용되고 있다.
Method
1. Inoculate 25ml of PAB or LB medium with a single, fresh, colony.
2. Incubate at 37℃ with vigorous aeration until late-log phase(OD600 1.0-2.0) is
reached.
3. Pellet cell by centrifugation(8000g, 10min, RT) and wash with 10ml of
lysis buffer.
4. Resuspend cells in 4ml of lysis buffer in a plastic centrifuge tube, add 10mg of lysozyme and incubate without shaking at 37℃ for 10min.
5. Add 0.3ml of 20% SDS and continue incubation for 5min
6. Add 4ml of phenol(saturated with TE buffer) and mix vigorously by inversion until emulsified.
7. Centrifuge(10000g, 10min, 4℃) and remove as much of the upper, aqueous phase as possible.
8. Re-extract with phenol/chloroform or chloroform.
9. Add 0.1 volume of 3M sodium acetate, pH 5.2, and 2.5 volumes of ice-cold ethanol(99%).
10. Retrieve the DNA precipitate and rinse with 70% ethanol, air-dry and dissolve in 1ml of TE buffer and determine the concentration of DNA.
* Lysis buffer : 50mM EDTA, 0.1M Na치, pH7.5
* DNA concentration(mg/ml) = (OD260 × 0.063) - (OD280 × 0.036)
Subject Small-scale Preparations of Plasmid DNA
Introduction : 플라스미드
플라스미드는 박테리아의 세포안에 존재하는 박테리아 크로모좀 이외의 작은 원형의 DNA분자 이다. 형태는 원형이고, 이중 나선으로 되어 있으며, 박테리아의 유전자와는 독립적으로 분열할 수 있는 능력을 가지고 있다. 그러한 이유로 유전자 클로닝을 위한 벡터로 많이 사용되는 것중 하나이다. 벡터란 유전자 클로닝 시에 우리가 원하는 유전자를 숙주 세포 안으로 이동시켜 그 안에서 다량으로 복제 가능하도록 하는 일종의 운반체를 말하는데, 플라스미드는 그를 위한 조건을 가지고 있다.
우선 자가 복제를 위한 복제 기점 (origin of replication)을 가지고 있으며, 유전자의 발현, 즉 삽입된 유전자의 전사를 유도하는 promoter, 나중에 세포 배양에 의한 대량 생산 후에 플라스미드가 들어간 세포와 그렇지 않은 세포를 구별해 내기위한 selective marker, 그리고 숙주 안에서의 copy number 를 조절하는 replicon, 그리고 원하는 유전자를 끼워 넣을 수 있는 insertion site 등을 가지고 있다. insertion site는 제한 효소에 의해 잘려질 수 있는 부위인데, 거기로 우리가 복제를 원하는 유전자를 삽입할 수 있다. 플라스미드와 항생제의 관계를 selection 에 있다. 유전자 클로닝 시에 플라스미드가 들어간 숙주세포와 그렇지 않은 세포를 가려낼 때 이용 하는 것 중 하나가 플라스미드가 가지는 항생제 저항성
유전자 이다. 플라스미드는 한개 또는 2개 이상의 항생제 저항성 유전자를 가진다. 이 유전자는 항생제를 분해할 수 있는 물질을 생산해 내는데, 플라스미드를

키워드

General PCR,   전기영동,   플라스미드,   제한효소,   형질전환,   실험