미생물학 실험 - Simple staining(단순염색), Gram staining(그람염색) 실험

소개글

미생물학 실험 - Simple staining(단순염색), Gram staining(그람염색) 실험에 대한 보고서 자료입니다.

목차

없음

본문내용

는 것이 중요하다. 각 단계에서 균의 색깔을 표로 정리 하였다.
그람양성균
그람음성균
1.Methylene Blue
푸른색
푸른색
2. Lugol soln
푸른색
푸른색
3. 95% EtOH
푸른색
무색
4.Safranin
푸른색
붉은색
<표 1-1> 첨가한 용액에 따른 균의 색깔 변화 양상을 정리한 표이다.
가장 중요한 단계는 탈색 과정이다. 탈색과정에서 초기 염색액의 색을 잃을 것이냐, 그대로 유지 할 것이냐가 이 실험의 핵심이다. 또한 탈색과정을 제대로 거치지 않는다면 잘못된 실험결과를 도출할 수 있다.
3)균의 모양 및 크기, 특성
크기(μm)
Gram (+)or(-)
모양
길이
너비
Escherichia coli
2.0
0.25-1.0
(-)
막대기 모양
Bacillus cereus
3-4
1
(+)
막대기 모양
Bacillus subtilis
3-4
1
(+)
막대기 모양
Micrococcus luteus
지름 0.53.5
(+)
원형
Staphylococcus aureus
지름 0.5-1.5
(+)
원형
2.실험재료
백금이, 알코올 램프, 비이커, 슬라이드 글라스, 유성펜, 시약(Methylene blue, Safranin, Lugol soln, 95% EtOH), 현미경
균주(이 중 4개를 선택해서 관찰함.)
-Escherichia coli
-Bacillus cereus =>제외
-Bacillus subtilis
-Micrococcus luteus
-Staphylococcus aureus
3.실험방법
1)Simple staining
먼저 백금이를 알코올 램프로 살균한 뒤 균주를 살짝 묻혀서 슬라이드 글라스에 물과 함께 도말한다. (균이 적을수록 결과가 잘나온다). 슬라이드 글라스를 알코올 램프 위를 왔다갔다 하여 열고정한다.(액체가 다 증발할 때 까지 지속한다). 단, 균이 타지 않도록 주의한다.
열고정이 완료되면 Methylene Blue용액과 Safranin 용액을 떨어 뜨리고 1분간 기다린다. 1분 뒤 염색액을 세척한다. 세척 후에 물기를 잘 제거한다. 그 뒤 현미경을 이용하여 슬라이드 글라스를 관찰한다.
2)Gram staining
먼저 백금이를 알코올 램프로 살균한 뒤 균주를 살짝 묻혀서 슬라이드 글라스에 물과 함께 도말한다(균이 적을수록 결과가 잘나온다). 슬라이드 글라스를 알코올 램프 위를 왔다갔다 하여 열고정한다.(액체가 다 증발할 때 까지 지속한다). 단, 균이 타지 않도록 주의한다.
열고정이 완료되면 Methylene Blue 용액을 떨어 뜨리고 1분간 기다린다. 1분 뒤 1차 염색액을 세척한다. 다음에는 Lugol soln을 떨어 뜨려 1분간 기다린다.(I2는 인체에 매우 해로우므로 조심하여 다룬다.) 매염제는 1차염색액과 복합체를 형성해 강한 결합을 일으킨다. 1분 뒤 Lugol soln 이 떨어진 부분을 세척한다. 다음과정으로 95% EtOH을 떨어 뜨린후 15초 대기한다.(너무 오랫동안 탈색하지 않는다.) 탈색액으로 인해 1차 염색액이 탈색된다. 세척 후에 2차 염색액인 Safranin을 떨어 뜨리고 2~30초 대기한다. 세척 후에 물기를 잘 제거한다. 그 뒤 현미경을 이용하여 슬라이드 글라스를 관찰한다.
4.실험결과
1)Simple staining
염색액
균주
Methylene Blue
사진
그림
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
Staphylococcus aureus
<그림1> Methylene Blue 염색 뒤, 현미경 확대사진(X400)
염색액
균주
Safranin
사진
그림
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
Staphylococcus aureus
<그림2> Safranin 염색 뒤, 현미경 확대사진(X400)
2)Gram staining
염색액
균주
사진
그림
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Micrococcus luteus
Staphylococcus aureus
<그림3> Gram 염색 뒤, 현미경 확대사진(X400)
5.고찰
먼저 단순염색에 대해 고찰하겠다. 이론적인 단순염색의 결과, 염색이 되는 균은 염색액의 색을 띠는게 정상이다. 우리조는 비교적 단순염색의 결과가 잘 나왔다고 볼 수 있지만, 아쉬운 점이 있는데, 바로 메틸렌 블루로 염색한 Escherichia coli의 경우 균이 관찰된 건지 아닌지 불확실한 면이 있다.
그렇다면 경우를 나누어서 먼저, 균이 관찰되었다고 가정해보자. 하지만 만약 균이 관찰되었다면 Escherichia coli는 간균임에도 불구하고 구균의 형태로 관찰되었다. 왜 그럴까? 그 해답은 열고정 과정에 있다. 열고정 방법은 건조될 도말 부위가 위로 향하도록 하여 알코올램프 불꽃의 2/3높이로 1초 정도 3~4회 통과시켜 고정시키는 방법이다. 우리조는 모든 균에대해 동일하게 이런 열고정 과정을 거쳤다. 바로 여기서 문제점이 나온다.
바로 균별 다른 세포벽의 구조를 가지고 있음에도 불구하고 동일한 열고정 과정을 거쳤기 때문이다. 이 설명은 http://aem.asm.org/content/74/11/3328 에서 확인할 수 있었다. 글의 내용중에 펩티도글리칸 층이 열의 저항성에 도움을 준다는 내용이 있다. 즉, 실험한 다른균에 비해 펩티도글리칸층이 얇은 Escherichia coli는열에 취약했고, 그 결과 균이 수축되었다고 생각해볼 수 있다.
이러한 점을 활용해서 실험을 고안해본다면, 서로 다른 간균을 비교해볼 때(-실험 결과 구균의 경우 불꽃에 심하게 노출될 경우 어떻게 변할지 비교해볼 만한 근거가 없다.) 균을 불꽃에 노출시키는 시간으로 균들의 펩티도글리칸 층의 두께여부를 간접적으로 판단해볼 수 있겠다.
다음으로 균이 관찰되지 않았다고 가정해보자. 이런 결과가 나오게 하는 요인은 무엇일까? 그런 요인으로는 처음에 다소 적은 균을 도말한 뒤, 물로 세척시 너무 강하게 세척할 경우를 생각해볼 수 있다. 그 결과 물로 세척을 할 때, 다소 적은 균을 도말해서 열고정 결과 물에 저항해서 지지하는 부분이 부족했을 것이다. 그래서 균이 다

키워드

미생물학 실험,   Simple staining(단순염색),   Gram staining(그람염색) 실험,   Simple staining(단순염색), Gram staining(그람염색)