Lysozyme의 분리(예비보고서)

소개글

Lysozyme의 분리(예비보고서)에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

은 그대로 두고 용액만 사용
― 기구
* 거즈, 250 mL 비이커 2개, 마그네틱바, 스포이드, Conical tube, 교반기, pH meter, Cold centrifuge(422호)
― 원심분리기 (Centrifuge)
* 원심효과 = 원심가속도 / 중력가속도
* 원심력의 크기 = 질량 × 반지름 × [각속도(RPM)]2
⇒ 물질의 질량이 클수록, 원심분리기의 반지름이 클수록, RPM이 높을수록 원심력이 큼
속도에 따른 원심분리기의 종류
* Low speed centrifuge : 6,000 RPM (6,000 g)이하, 세포나 핵
* High speed centrifuge : 20,000~25,000 RPM (60,000 g), 세포, 핵, 세포내 소기관 등
* Ultracentrifuge : 40,000~80,000 RPM (600,000 g), 세포막 구성성분, 거대분자
원심분리의 방법에 따른 분류
* 편차 원심분리 (Differential centrifugation)
- 크기는 비슷하지만 밀도가 다른 입자를 분리하는데 유용하다.
- 단점 : 튜브의 위쪽에 있는 큰 입자가 침전되는 동안 아래쪽의 작은 입자가 함께 침전되어 세포의 회수율이 떨어지고 손상을 입기 쉬운 물질의 분리에는 적용하기 힘들다.
- 장점 : 분리에 소요되는 시간이 짧고 가격이 경제적이다.
* 밀도 기울기 원심분리 (Density gradient centrifugation)
- 원심분리 중의 대류(convection)에 의한 혼합을 방지
① 속도 침강 원심분리 (rate-zonal centrifugation)
- Sucrose나 glycerol과 같은 수용성 비활성 유기물질을 첨가하여 원심분리관 내의 액체를 안정시켜 대류를 방지하고 원심분리 후 용액상에서 뚜렷한 띠로 분리하기 쉽게 해준다.
- 밀도 기울기를 이용한 방법으로 크기가 다른 입자가 동시에 침전되는 것을 방지한다.
- 시료를 넣을 때 밀도기울기 매질의 가장 윗면으로 매질이 섞이지 않도록 조심해서 주입하고 원심분리 시 저속으로 짧은 시간 동안 실시하여야 한다. 그렇지 않으면 모든 입자가 바닥에 가라앉게 된다.
② 등밀도 원심분리 (Isopycnic centrifugation)
- 밀도에 기초하여 입자를 순수하게 분리하는 방법
- 입자가 등밀도 위치에 존재하고 있기 때문에 고속으로 오랜 시간 동안 원심분리 하여도 입자에 아무런 영향을 주지 않는다.
원심분리의 로터(rotor)의 종류
: 로터의 강도는 속도의 제곱에 비례한다.
* 수평로터 (Swing-out rotor) : 로터가 축에 대하여 수직으로 회전
- 고정각 로터나 수직 로터보다 적은 양의 시료를 처리, 속도침강 원심분리와 등밀도 원심분리에 이용되고 입자들의 침강거리가 길기 때문에 대류현상을 감소시키지만 편차원심분리에는 적합하지 않다.
* 고정각 로터 (Fixed-angle rotor) : 일정한 각도(15~40°)로 회전
- 침전 거리가 짧기 때문에 침전물 형성에 이용되고 편차원심분리에 적합하다.
4. 실험방법
① 계란 흰자(계란 3개)에 흰자 부피의 1/10 정도의 증류수를 첨가 후 시계접시(또는 plate dish 뚜껑)로 덮고 1시간 동안 stirring 한다.⇒ Lysozyme이 증류수에 녹아나게 하기 위함이니 stirring을 너무 심하게 하여 거품이 일어나지 않도록 주의하면서 적당한 속도로 저어준다.⇒ 증류수 사용 이유 : 효소는 수용성 단백질이기 때문에 증류수에 녹아 나온다.
② 250 mL 비이커 입구에 거즈를 덮고 움푹 들어가게 하여 고무줄로 입구를 묶고 ①번의 용액을 안전하게 붓는다.⇒ 투명한 노란색 액체는 빠져 나오게 되고 흰 거품만 남게 된다.
③ 거른 용액 부피의 5%에 해당하는 과포화 NaCl 용액을 첨가한다.⇒ 과포화 NaCl 용액 : 활성 부피에 Na+가 결합해서 침전 형성 (염석)⇒ 제조법 : NaCl을 증류수에 넣고 녹지 않을 때까지 계속 첨가한 후 더 이상 녹지 않을 때 가라앉은 NaCl은 그대로 두고 용액만 사용한다.
④ pH=11이 되도록 0.5 N NaOH를 첨가한다.⇒ 강염기에서 Lysozyme은 전기적으로 비극성이 되고 따라서 수용액과 섞이지 않아 침전하므로 가라앉기 쉽다. 즉 정전기적 반발이 적어서 침전되기 쉽다.
⑤ 비이커 전체를 호일로 싼 후 1주일 동안 냉장 보관
⑥ 4,000 RPM에서 6 min 동안 원심분리를 한다.
⑦ 침전물 무게 측정 (빈 conical tube의 무게를 먼저 잰 후 침전물 무게 측정)

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Lysozyme,   생화학실험,   예비보고서,   실험보고서