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plasmid DNA를 분리하는 방법을 익히고, 전기영동의 원리에 대해 알아보고 실험해보며, DNA정량 하는 법을 배운다.
Plasmid DNA 분리는 주로 miniprep라 부르는 방법으로 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. Plasmid 정제는 total cell DNA의 일반적인 분리방
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DNA와는 별도로 발견되는 작은 DNA, Chromosomal DNA와 비교해 볼 때 크기가 상당히 작고 스스로 복제가 가능
인위적으로 Plasmid를 다른 Bacteria에 감염시킬 수 있고, 이를 이용해 유전형질을 쉽게 변환시킬 수 있으며, 순수하게 분리, 정제하기도 쉽기
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dry시킨다.
ⅹ) Pellet을 TE(pH 8.0) with RNase(final 20μg/ml) 50μl에 녹인 후 37℃에서 30분간 incubation한 후 -20℃에 보관한다.
☞ 분리된 DNA의 정량
ⅰ) UV spectrophotometer를 10분 정도 미리 켜두어 발생되는 자외선을 안정화 시킨다.
ⅱ) 실험에서 얻은 DNA 용
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plasmid DNA는 튜브의 옆 면에 구멍을 뚫어서 주사기로 추출할 수 있다. EtBr은 buthanol로 추출할 수 있고 이렇게 얻은 plasmid DNA는 거의 100% 순수하다. E.coli의 DNA 추출방법
① 전자동 핵산 추출정제 장치 이용
② 크기에 기초한 분리
③ 구조에
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내려오면 자외선 하에서 확인한다.
『EtBr는 DNA 이중나선에 삽입되어 UV에 노출 시 형광을 나타내는 물질로 이를 통해 DNA의 위치확인 및 정량을 할 수 있다.(DNA와 붙어있을 때와 그렇지 않을 때의 UV에 대한 fluorecence의 life time의 차이가 있기 때
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니를 5ml 멸균된 LB medium에서 overnight 한다(37℃에서 최소한 mid-log phase 까지 배양한다).
2. 1.5ml의 종배양액을 1.5ml microcentrifuge tube에 옮기고 원심분리하여 cells을 모은다 (pellet). 상등액을 제거한다.
3. 200㎍ lysozyme이 든 STET soln. 300㎕에 pellet을 녹인
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plasmid DNA를 renature시키는 역할을 하기 때문에 첨가되지 않으면 정상적인 plasmid의 expression이 일어나지 못하기 때문이고, galctose가 첨가 되지 못하면 LacZ의 발현이 일어나지 않으므로 당연히 β-galact-
-osidase가 발현되지 않는다. 그리고 X-gal은 β-ga
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DNA를 그대로 전기영동하면 아래사진과 같은 결과를 얻을 수 있다. 분리가 아주 잘 되면 대부분 supercoiled form DNA만 보이지만 분리과 정에서 작은 충격을 입어서 open circular form이 조금 나타날 수도 있다.
3. 결 론
⇒앞에서 보아온 플라스미드의
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A 조각을 감지하기가 어렵게 된다. 이렇게 되는 경우에는 gel을 ethidium bromide가 0.5 μg/ml 포함된 증류수나 1x TAE 용액에 30∼45분간 담가 염색하였다가 관찰하면 된다.
- 파장 254 nm에서의 자외선 : DNA에 흡수되어 색소에 전달
- Ethidium bromide는 단일
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DNA가 이동되는 정도나 DNA가 gel에서 분리되는 정도가 달라진다. 따라서 효소 억제제와 nuclease가 함유되어 있지 않으며 ethidium bromide로 염색할 경우 형광의 배경을 극소로 하기 위한 특별히 정제된 agarose를 사용해야한다. 전기영동 tank와 gel은 동
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