형질전환 실험_Transformation_예비레포트 [A+]

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목차

1. 실험 목적
2. 바탕 이론
3. 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 참고 문헌

본문내용

트랜스펩티데이스에 비가역적인 억제제로 작용해 효소의 활성을 억제함으로써 세포의 융해를 유도하는 매커니즘을 따른다. 또한 살균 효과를 나타내며 넓은 항균 영역을 보유하고 있어서 그람 양성균과 그람 음성균, 렙토스피라(Leptospira) 등에 효과적으로 작용한다.
Fig 6. 암피실린의 화학구조
3. 기구 및 시약
① 1.5ml Micro tube
② Incubator (항온기)
Fig 7. Micro tube
- 미량 분석이나 반점 분석에 이용되는 소형의 시험관으로, 원심분리기에 사용되기 때문에 microcentrifuge tube라고도 한다.
Fig 8. Incubator
- 세균을 배양하기 위한 목적으로 사용되며, 일정한 최적 온도를
유지해주는 기구이다. 이번 실험에서는 37℃를 유지시켜주는 용도로 사용된다.
③ Micropipette 10μl, 100μl
④ Ampicillin (1000X)
Fig 9. Micropipette
- 미량 분석에서 이용되는 미량 액체의 부피를 정확하게 채취, 배출시키기 위한 기기이다.
Fig 10. Ampicillin의 화학구조
- 반합성의 페니실린 항생제로, 아미노페니실린(aminopenicillin) 계통의 하나이다. 이는 세포질 막 안의 페니실린 결합 단백질과 결합해 박테리아의 세포벽에서 일어나는 최종 펩티드전이 단계를 방해해 펩티도글리칸의 합성과 세포벽의 형성을 방해한다.
⑤ BL21 (E.coli competent cell)
⑥ Recombinant DNA
Fig 11. BL21
- DNA를 삽입하기 쉽게 하기 위해 미리 처리된 E.coli competent cell이다. 일반 균주보다 단백질 분해효소를 더 적게 발생시키도록 돌연변이화한 균주이기 때문에 단백질 생산에 적합하다.
Fig 12. 재조합 DNA
- 제한효소를 이용해 eGFP 와 또다른 유전자가 재조합된 pET-22b(+)를 사용한다.
⑦ Autoclave (고압멸균기)
⑧ Agarose (한천)
Fig 13. Autoclave
- 멸균하기 위해 사용하는 장치로, 밀폐상태에서 121℃, 15psi의 고압증기를 사용한다.
Fig 14. Agarose
- Agarose(한천)는 이번 실험에서 고체배지를 만들기 위해 넣어주는 물질로, 액체상태의 배지에 넣으면 배지를 굳게 한다. 붉은 해초에서 추출한 다당류인 포도당이 주성분이며, 불활성 지지물의 역할을 한다.
⑨ LB배지 (Yeast extract, NaCl, Tryptone)
- 미생물의 성장에 필요한 여러 영양분을 포함하며, 각종 박테리아를 배양하는 데 사용되는 배지이다.
Fig 15. LB배지
LB 배지의 성분
역할
Yeast extract (효모 추출물)
0.5g
박테리아가 생장하는 데 필요한 각종 영양소가 들어있는 효모에서 추출한 물질이다.
NaCl (염화나트륨)
1g
세포가 삼투에 의해 터지지 않도록 해주며, 세균의 신호전달 체계에 필요한 이온을 공급해준다.
Tryptone
0.5g
박테리아의 성장에 필수적으로 필요한 아미노산을 공급해준다.
물
배지성분의 95%을 차지하며 증류수나 탈 염수를 사용한다.
Table1. LB 배지의 성분
※ 실험 시 유의사항
- Autoclave 사용 시 고온 상태에서 실험하므로 폭발을 주의해야 한다.
- Autoclave로 멸균 시킨 뒤 압력과 온도가 충분히 떨어지고 나서 뚜껑을 열어주어야 한다.
- Incubator (항온조) 사용 시 온도를 37℃로 일정하게 유지해야 한다.
- 배지가 오염되지 않도록 주의한다.
- 세균을 배양할 때 다른 세균과 섞이지 않도록 주의한다.
- 고체 배지로 만들 때 고체 배지가 담긴 페트리접시는 꼭 뒤집어 보관해주어야 한다.
4. 실험 방법
LB 고체배지 조성
100ml 기준
Tryptone
1g
Yeast Extract
0.5g
NaCl
1g
Agarose
1.5g
(1) 위의 조성으로 LB 고체배지를 만든 후 Autoclave로 멸균한다.
(※ Autoclave 사용 시 주의한다.)
(2) 60 ℃ 이하가 되었을 때 Ampicillin (1000X)을 넣고 Petri dish에 20 ml씩 넣고 식힌다. (총 2개)
(3) 재조합 된 DNA를 아래와 같은 비율로 1.5 ml Microtube에 넣는다.
조성
부피 (Volume)
Recombinant DNA
4 μl
BL21 competent cell
40 μl
Total
44 μl
(4) 얼음에서 10분간 반응시킨 용액을 고체 배지에 옮겨 Spreader로 고르게 도말하고, 마찬가지로 대조군에 해당하는 고체배지에 DNA를 넣지 않은 BL21을 도말한다.
(5) 도말이 끝난 배지는 Parafilm으로 Petridish를 감싸 Incubator에서 배양한다. (37 ℃, 14~18시간)
(6) 각각의 고체배지를 비교한다.
(※ 배양된 균은 Autoclave를 통해 멸균한 뒤 폐기한다.)
5. 참고 문헌
- 분자생물학, Weaver, Lifescience. (2013).
- Microbiology &Immunology , Subhash Chandra Parija, 2nd ed.
- Alcamo’s Fundamentals of Microbioloby (Jeffrey C. Pommerville, 7th ed
- Drawz, S. M.; Bonomo, R. A. \'Three Decades of β-Lactamase Inhibitors\'. Clinical Microbiology Reviews. 23 (1): 160201. (2010).
- Petri \'Penicillins, Cephalosporins, and Other Beta-Lactam Antibiotics\'. In Brunton, Laurence; Chabner, Bruce; Knollman, Bjorn. Goodman and Gilman\'s the Pharmacological Basis of Therapeutics, Twelfth Edition (12th ed.). New York: McGraw Hill Professional. p. 14771504. (2011).

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