제한효소를 이용한 Restriction of DNA_결과레포트 [A+]

소개글

제한효소를 이용한 Restriction of DNA_결과레포트 [A+]에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Abstract
2. Experiment
3. Result
4. Discussion
5. Reference

본문내용

기와 가깝지만 넣어준 제한효소의 양 등 오차로 인해 조금 크기가 다르게 측정되었다. 다음으로 4조는 Eco R I &Xho I를 넣어주었기 때문에 Fig 11.에서의 두 제한효소가 작용했다고 보면 1.7kbp와 나머지 부분을 더한 0.8kbp+5.5kbp=6.3kbp 두 개의 DNA 단편이 발견되어야 한다. 하지만 4조는 1.7kbp와 6.3kbp 두 개의 단편은 일치하지만 추가적으로 7.0kbp의 단편이 하나 더 발견되었다. 이는 다른 종류의 DNA가 오염되어 스타활성이 나타났거나 전기영동 시에 전기영동 완충액에서의 다른 DNA오염의 가능성도 있다고 생각한다. 5조는 Eco R I &Nde I를 넣어주었기 때문에 마찬가지로 Fig 11.에서 두 부분을 자른다고 생각하면 0.8kbp와 1.7+5.5=7.2kbp 2개의 DNA 단편이 나와야 하는데, 5조는 실제로 7.2kbp의 DNA 단편 하나만 뚜렷하게 관찰되었다. 이것은 실제 7.2kbp의 DNA 단편과 일치하지만 추가적으로 있어야 하는 0.8kbp의 DNA 단편은 농도가 너무 작아 눈으로 측정하기 힘들 정도로 흐릿하게 나온 것이라고 생각한다. 마지막으로 우리 6조는 Xho I &Nde I를 넣어주었기 때문에 5.5kbp와 0.8+1.7=2.5kbp 2개의 DNA 단편이 나와야 한다. 이는 전기영동 결과와 정확히 일치하기 때문에 우리 조가 실험을 성공적으로 진행했다고 할 수 있다.
※ 점착성말단과 비점착 말단
제한효소가 DNA를 절단한 뒤 잘린 부위는 점착성 말단 (sticky end)과 비점착성 말단(blunt end) 두 종류로 분류할 수 있다. 점착성 말단은 이중가닥의 DNA를 엇갈리게 절단하여 서로 상보적인 단일 가닥이 튀어나온 DNA조각을 생성하며, 잘린 부위의 DNA가 엇갈리게 비대칭적으로 나타난다. 이 경우 잘린 부위는 5\' 말단에 4개의 뉴클레오타이드가 돌출되어 있어 나중에 DNA를 연결효소 (ligase)로 붙일 때 뉴클레오타이드 사이에 수소결합이 일어나 연결이 용이하다.
이와 반대로 비점착성 말단은 평편 말단이라고도 하며, 대칭축에서 이중가닥을 한꺼번에 절단하여 DNA의 잘린 부위의 말단 위치가 동일하며 완전한 염기쌍을 이룬다. 5‘ 말단이나 3’ 말단이나 모두 돌출된 뉴클레오타이드가 없으며, 이 경우 연결효소로 DNA를 붙이기가 더 어렵다.
Fig 12. 점착성 말단 (왼쪽, Sticky end)과 비점착성 말단 (오른쪽, Blunt end)
※ 스타 활성 (Star activity)
스타활성은 제한 효소가 최적의 반응 조건과 상당히 다를 때, 효소 본래의 특정 절단 부위 외의 DNA를 무작위로 절단하는 활성이다.
실험 과정에서 스타활성이 생기는 원인은 크게 두가지가 있다. 첫 번째는 마이크로 피펫을 이용해 반응 용액을 제조할 때 DNA를 넣어준 다음 제한효소를 넣어야 하는데, 제한효소를 DNA 보다 먼저 넣어버리면 효소의 농도 > DNA의 농도가 되어버리기 때문에 최적의 반응조건과 달라져 이상이 생기고 결과적으로 스타활성이 생길 수 있다. 두 번째는 적은 제한효소의 양으로 인한 스타활성이다. 이번 실험에서 반응용액을 제조할 때 넣어주는 제한효소는 각 1μl씩으로 매우 소량인데, 이 양에 조금이라도 차이가 나게 되면 실험의 결과에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 피펫 팁을 용액 맨 밑까지 넣지 말고 용액의 계면에서 채취해야 한다. 왜냐하면 계면에서 채취하지 않으면 피펫 주변에 묻게 되는 효소의 양이 더 많아져 원래 양보다 더 많이 첨가될 수 있기 때문이다. 원래 양보다 과량 효소를 첨가하게 되면 스타활성이 생기며, 이는 2개 이상의 제한효소를 이용하는 경우에 더 스타활성이 일어날 가능성이 크므로 우리 조가 진행했던 실험에서 매우 주의해야 할 부분이었다. 스타활성이 일어나게 되면 원하는 위치가 아닌 다른 부분이 무작위로 절단되기 때문에 전기영동 결과 DNA의 크기가 이론적인 크기와 다르게 나올 수 있다. 따라서 이러한 스타 활성이 발생하는 것도 오차의 원인이라고 생각한다.
※ 제한효소의 절단 원리
- 세균은 바이러스에 대한 방어 기작으로 제한효소를 사용한다. 대장균의 경우 박테리오파지에 의해 파지의 DNA가 내부로 들어오면 이를 제한효소를 이용해 조각내버린다. 그런데 이렇게 제한효소가 DNA를 절단시키는데 자기 자신은 절단되지 않는 이유는 바로 대장균의 메틸화 작용 때문이다. 즉, 대장균은 제한효소의 공격을 받기 전 미리 자신의 DNA를 Modification enzyme을 이용해 메틸화시켜 두기 때문에 자신의 제한효소가 인식하지 못하게 하기 때문에 DNA만을 절단할 수 있다.
마지막으로 이론적으로 PCR에서 얻을 수 있는 증폭된 DNA의 크기를 알아보자. PCR 실험에 사용한 plasmid DNA는 유전자 재조합된 pET-22b(+)이며, PCR mixture 제작에 사용한 Forward primer는 T7 primer(T7 promoter), Reverse primer는 T7 Terminator primer이다. 다음 Fig 13.은 pET-22b(+)의 염기 서열 중 이 두 프라이머의 sequence landmarks이다.
따라서 T7 promotor는 361-377, T7 terminator는 26-72이고, Forward primer와 Reverse primer는 T7 promoter와 T7 Terminator의 부위에 상보적으로 결합해 DNA의 합성을 진행하므로 우리가 기대할 수 있는 Target DNA의 크기는 (377-26= 351bp =0.351kbp)이다. 그러나 26-377의 염기 서열 사이에 Xho1(158), EcoR1(192),
Nde1(288)의 제한효소(Fig 4.)가 있고, eGFP (0.8kpb)와 another gene (1.7kbp) 또한 함께 증폭되었을 것이다. 따라서 우리가 이번에 사용한 복제할 DNA의 크기인 2.5kbp에 0.351kbp의 길이를 더해주면 이번 실험에서 얻을 수 있는 이론적인 Target DNA의 크기는 2.851kbp가 나오게 된다.
5. Reference
[1] 미생물 실험서/ 유민, 김병오, 이혜영 공저/ p.68-75

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생물화학공학,   화학공학,   화학공학실험,   생물실험,   결과레포트,   실험결과,   제한효소,   DNA절단