세포배양

소개글

세포배양에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1)Title 동물세포 계대배양(subculture)

2)배지교환

3)Purpose

4)세포 배양에 있어서 혈청의 역할
♦Trypsin 설명과 사진
♦EDTA 설명
♦HeLa Cell 설명과 사진

5) <세포계대 (transfer or passage)>

6)세포수 계산

본문내용

무 빽빽하게 증식하기 전에 계대하는 것이 좋다. 어떠한 경우든, 계대전날에 배지교환을 하여 세포를 원기 왕성하게 한 후에 계대하는 것이 바람직하다.
※ PBS(-)
NaCl을 넣어 등장용액으로 만든 인산완충용액(phosphate buffer)으로, Dulbecco\'s phosphate buffered saline(PBS)를 넣어 만든, 2가 이온이 들어가 있지 않은(Ca, Mg-free)것을 PBS(-)라고 한다. 세포끼리의 접착이나 세포와 기질과의 접착에는 칼슘을 매개로 이용하는 것들이 있기 때문에, 세포현탁액을 만들 때에는 PBS(-)로 세정한다. 30분 이상 현탁액으로서 보존할 때에는 배지를 이용하는 것이 좋다.
※ Trypsin/EDTA(PET)
배양용기벽에 부착하여 증식하는 세포를 계대하기 위해서는 세포와 세포간, 세포와 배양용기벽과의 접착을 떨어뜨려, 단일 세포로 된 현탁액(cell suspension)으로 만든 후, 이것을 희석하여 배양한다. 단백질에 의한 접착을 trypsin으로, 칼슘을 통한 결합을 EDTA로 파괴하여, 세포를 하나씩 분리한다. PET처리를 중지시키는데는 일반적으로 혈청이 들어가 있는 배지를 첨가시켜 행한다.
▷ 항온조에서 얼음을 녹일 경우 trypsin이 자기 소화하는 것을 피하기위해 빨리 항온조에서 꺼낸다.
▷ 차가운 상태로 용액을 사용할 경우, 차가운 용액이 세포에 닿으면, 세포가 배양용기에서 분리되는 경우가 있다. trypsin은 온도가 높을 때 효력을 잘 나타내지만, 37℃로 될 때 까지 기다리지 않아도 된다. 실온정도로 따뜻해졌을 때 사용하도록 한다.
※ 세포수 계산
▶ 혈구계산판의 사용
혈구계산판을 수평으로 유지하여 주입하는 느낌이 아니라, 모세관 현상으로 계산판에 흡수 되도록 한다. 액체의 흡수속도가 너무 빠르면 세포가 미쳐 흡수되지 않아, 세포분포가 불균일하게 된다.
▶ 측정
cell의 농도가 높으면 카운트하기 어렵고, 너무 낮으면 정확하지 않으므로 1mm 네모 테두리 안에 대개 100개 정도의 세포가 있도록 농도를 조절한다. 적어도 4번 counting하며 측정결과가 ±10%이내에 들도록 한다.
※ 생세포 counting (dye exclusion)
세포 현탁액을 만들었을 때 살아있는 세포(생세포)와 죽은 세포의 비율(생세포율), 혹은 살아있는 세포만의 수를 알고 싶은 경우가 있다. 생세포를 구별하는데 자주 사용되는 것으로 trypan blue를 이용한 색소배제법이 있다. trypan blue에 의해 푸르게 염색되어 있는 세포를 죽은 세포로 구분하여 counting한다. 살아있는 세포도 시간이 경과함에 따라 점차로 염색되기 때문에, trypan blue용액을 첨가하여 즉시 계산판에 넣어 계산한다.
※ 세포현탁법
가능하면 큰 피셋으로 많은 양의 용액을 빨아들여 천천히 내뿜는 것에 의해 세포를 분산시킨다. 침전상태에 따라 다르지만, 비교적 단단한 경우에는, 소량의 배지를 첨가하여 우선 피펫으로 덩어리를 pipetting으로 현탁하고, 다음에 필요량의 배지를 첨가하여 섞는 편이 낫다. 단단한 침전에 처음부터 많은 양의 용액을 첨가하면, 침전이 덩어리채로 부유하여 덩어리가 분산되지 않기 때문이다.
☆ 분주방법
피펫으로 세포현탁액을 흡인하여 들인 다음, 빨리하지 않으면 피펫내에서 점점 세포가 가라앉기 때문에, 용액의 위와 아래에서 세포 농도차가 생긴다. 반대로 용액을 떨어뜨리는 속도가 너무 빠르면, 세포가 미쳐 떨어지지 못하고 용액 위쪽에 세포가 모이게 된다. 적당하고, 일정한 속도로 세포 농도가 불균일하게 되지 않도록 떨어뜨리는 것에 익숙해지도록 하며, 피펫내에서 농도차가 생겼다면, 원래의 현탁액에 되돌려 다시 흡인한다.
☆ 세포에 의한 conditioning
일반적으로, 세포는 배양 중에 각종 물질을 배지중에 분비하여, 결과적으로 배지를 자기자신에게 적합한 상태로 변화시키는데, 이것을 세포에 의한 conditioning이라고 한다. 많은 세포를 분주했을 때에는 conditioning이 빠르게 일어남으로 그것의 필요성을 알아차리지 못하는 경우가 많지만, 적은 수의 세포를 분주했을때는 신선한 배지에 conditioning medium을 반정도 섞으면 colony형성율이 높아지는 경우가 있다.
<세포동결보존>
원칙적으로 세포분열하는 세포 즉 증식성 세포를 동결보존해야한다. 동결보존시 원칙적으로 세포분열하는 세포 즉 증식성 세포를 사용하여야 하며 동결전 세포의 성장상태는 log phase(지수성장기)가 좋으므로 계대

키워드

세포배양,   cell culture,   cell line,   동물세포,   계대배양,   세포증식