[효소공학실험] Lowry법에 의한 조단백질정량

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[효소공학실험] Lowry법에 의한 조단백질정량에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

bration > Erotation의 순이다
③ Beer\'s Law
전자기 복사선의 세기 즉, 복사력(radiant power) P는 초당 일정한 면적에 도달하는 빛살의 에너지이고, 세기(intensity) I는 단위 입체각(solid angle)에 작용하는 복사력이다. 이 양은 진폭의 제곱과 관련이 있다.
△ 분광광도기의 모식도
흡광도를 광도(optical density)라고도 하는데, 약자로 OD 또는 E라고도 한다. 흡광도가 중요한 이유는 이것이 시료 중에 함유되어 있는 빛을 흡수하는 화학종의 농도에 정비례하기 때문이다. 이 때 분자들에 의해서 흡수되는 흡광도에 대한 관계는
A = ε * b * c 이다.
A: 흡광도 ε: 물질 고유의 몰흡광계수(molar absorptivity)
b: cuvette의 직경 또는 폭 c: 물질의 농도
* 시약 및 기구
① 단백질 정량할 시료 : 미지의 BSA
② 단백질 표준용액 : BSA(Bovine serum albumin)
③ 시약 : solution A = 2% Na2co3 2g + 0.1N NaOH 0.4g + DW 100㎖
solution B = 1% CuSO4 5H2O 0.5g + DW 50㎖
solution B = 2% NaK tartrate 4H2O 1g + DW 50㎖
④ Folin-ciocalteu\'s phenol reagent, 2N(sigma F9252)
⑤ 분광광도계(spectrophotometer)
⑥ Vortex mixer
* 실험방법 및 결과
① 미지의 농도 BSA 시료 200㎕를 8㎖ vial에 담는다.
② BSA(Bovine serum albumin : BSA 1㎎을 DW 1㎖에 녹인 시료))를 농도별로 희석(0, 100, 250, 500, 750㎍/㎖)해서 각각 200㎕씩 8㎖ vial에 담는다.
희석농도(㎍/㎖)
들어간 BSA1㎎/DW1㎖의 양(㎕)
들어간 DW의 양(㎕)
0
0
200
100
30
270
250
45
180
500
100
100
750
180
60
*희석방법
※ scaaing의 목적으로 250(㎍/㎖)짜리는 하나 더 200㎕을 8㎖ vial에 담는다.
③ 각각의 tube에 solution C 1㎖첨가 → vortexing → 정확히10분간 반응시킴.
solution A : B : B = 100 :1 : 1
→ 주의사항 : A → B → B 순서대로 섞어야 한다.
④ Folin시약 50㎕를 넣어 발색시킨다 → vortexing → 30분간 반응시킴.
⑤ 750㎚에서 spectrophotometer로 흡광도를 측정한다.
BSA시료
흡광도(OD값)
735㎚
750㎚
0㎍/㎖
-0.0837
-0.1007
100㎍/㎖
0.2842
0.2717
250㎍/㎖
0.6955
0.6826
500㎍/㎖
1.0622
1.0462
750㎍/㎖
1.3589
1.3364
미지시료
0.7449
0.7278
* scaaing의 목적으로 하나 더 만든 250(㎍/㎖)짜리로 scanning한 결과, 이론상으로는 750㎚에서 최대흡광도를 가지지만, 실제로는 735㎚에서 최대흡광도값을 가졌다. 따라서 735㎚와 750㎚파장에서 OD값을 측정해 보았다.
파장 750㎚에서 측정한 BSA시료의 농도에 따른 흡광도 그래프
실험값으로 얻은 그래프의 추세선식 : y = 0.0018x + 0.0573
신뢰도 R = 0.949
미지시료의 농도를 구하여보면, 750㎚에서 0.7278의 흡광도 값을 나타내므로 위의 추세 선식에 대입한 결과 0.7278 = 0.0018x + 0.0573, x = 372.5
∴ 추세선상에서 구한 미지시료의 농도 = 372.5㎍/㎖
하지만, 아래의 그래프과 같이 농도에 따른 흡광도 값을 곡선으로 이은 그래프와 추세선은 정확히 100%일치하지 않는다. 따라서 0.7278의 흡광도 값에 대한 x축값(시료 의 농도)에 차이가 발생한다.
그래서 x축 주단위의 눈금값을 10으로 설정하여 얻은 그래프가 바로 아래 그림이다. 여기에서 0.7278의 흡광도 값에 해당하는 곡선상의 x값은 정확히 한 점을 찍을 수는 없으나 그 범위를 알 수 있다. 즉, 270 < X < 280임을 구해볼 수 있었다. 따라서 미지시료의 750㎚파장에서의 흡광도 값인 0.7278와 추세선의 교점보다 직접 시료의 흡광도 값을 곡선으로 이은 그래프와의 교점이 신뢰도가 더 높은 값일 것이므로 좀 더 정확한 미지시료의 농도는 270㎍/㎖ < X < 280㎍/㎖ 사이의 값임을 유추해 볼 수 있었다.
파장 735㎚에서 측정한 BSA시료의 농도에 따른 흡광도값
실험값으로 얻은 그래프의 추세선식 : y = 0.0019x + 0.0705
신뢰도 R = 0.9515
미지시료의 농도를 구하여보면, 735㎚에서 0.7449의 흡광도 값을 나타내므로 위의 추세 선식에 대입한 결과 0.7449 = 0.0019x + 0.0705, x = 345.9
∴ 추세선상에서 구한 미지시료의 농도 = 345.9㎍/㎖
하지만, 아래의 그래프과 같이 농도에 따른 흡광도 값을 곡선으로 이은 그래프와 추세선은 정확히 100%일치하지 않는다. 따라서 0.7449의 흡광도 값에 대한 x축값(시료 의 농도)에 차이가 발생한다.
따라서 위에서 750㎚파장에서 측정한 흡광도 값과 같이 x축 주단위의 눈금값을 10으로 설정하여 그래프를 다시 그려보았다. 여기에서 0.7449의 흡광도 값에 해당하는 곡선상의 x값은 정확히 한 점을 찍을 수는 없으나 그 범위를 알 수 있다. 270 < X < 280임을 구해볼 수 있었다.
750㎚에서 측정
732㎚에서 측정
추세선과의 교점
X = 372.5㎍/㎖
X = 345.9㎍/㎖
곡선과의 교점
(실험값들을 이은 선)
270 < X < 280㎍/㎖
270 < X < 280㎍/㎖
※ X : 미지시료의 농도(㎍/㎖)
* 실험고찰
* 참고문헌
- 네이버 지식인 : http://kin.naver.com
- 네이버 백과사전 : http://100.naver.com
- 대학 기기분석(제1판) | 기기분석 교재연구회 | 자유아카데미 | 2000, 257~258p
- 분석화학(제8판) | 분석화학 교재연구회 | 자유아카데미 | 2004, 823p

키워드

Lowry법,   단백질 정량,   조단백질,   BSA,   분광광도계,   단백질 분석,   생화학 실험,   흡광도,   Folin 시약,   실험보고서