[분자유전학실험]1.DNA Ligation

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5. Discussion
6. Reference

본문내용

6.67ng = x μl : 50ng
x = 50/26.67
= 1.9 μl
※ 우리가 가지고 있는 sample vector 26.67ng/μl를 이상적으로 사용해야 할 vector의 양 50ng으로 맞춰주기 위함이다. 26.67ng에 1.9배를 했을 때 50ng이 되므로 1μl의 1.9배 인 1.9μl를 넣어준다.
② insert
1μll : 60ng = x μl : 12.5ng
x = 12.5/60
= 0.4 μl
※ 우리가 가지고 있는 sample insert 60ng/μl를 이상적으로 사용해야 할 insert의 양 12.5ng으로 맞춰주기 위함이다. 60ng에 0.4배를 했을 때 12.5ng이 되므로 1μl의 0.4배인 0.4μl를 넣어준다.
5. Discussion
Figure 2과 figure 3의 전기영동 사진을 보면 uncut vector에는 여러 가지 형태의 band가 나왔지만 cut된 vector와 insert는 한 가지 형태의 band가 나온 것으로 보아 제한효소에 의해서 잘 잘려졌음을 알 수 있다. 따라서 실험에서 Ligation을 한다는 것은 이미 Insert와 Vector을 제한 효소를 이용해서 자른 상태임을 의미하며, Ligation하기 위해서는 잘라준 Insert와 Vector를 정제하는 과정이 꼭 필요하다. 이유는 정제를 통해서 불필요한 요소들을 제거해주고 남아있는 제한효소를 불활성화 시켜주어야 하기 때문이다. 또한 일반적으로 Ligation은 DNA 말단 구조에 따라 반응속도가 달라지기 때문에 DNA의 말단 형상에 따라 첨가하는 효소의 양이나 반응 시간 등을 조절해야 한다. 따라서 실험을 시작하기 전에 먼저 자신이 삽입할 유전자가 blunt end 또는 sticky end 인지를 확인해야 한다.
cohesive end보다 blunt end의 결합력이 낮아서 ligation 효율이 떨어지기 때문에 reaction protocol 최적 조건 달라 Blunt end는 Sticky end보다 ligase가 더 많은 양이 필요하기 때문이다. 그 밖에 ligation의 효율을 높이기 위해서 삽입할 insert DNA 와 vector 비율을 적절히 맞추어야 좀 더 효율적인 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
▶ 다른 실험을 통한 Ligation 결과 고찰
[Figure4. T4 DNA ligase의 효과. 1% agarose : 시간과 Unit의 차이에 의한 ligation의 효율과 NA ligase의 효과를 볼 수 있다. Ligation은 작용하는 온도범위가 커서 온도와 시간이 우리의 편의에 의해 조절이 가능하다. 2Unit을 넣었을 때 ligation이 제일 잘 된 것을 확인 할 수 있다. 0.2Unit 또는 0.02Unit을 넣었을 때에는 시간을 45분이나 주었지만 ligation이 된 것을 볼 수 없었다. 하지만 2Unit을 넣었을 때에는 5분과 45분 모두 ligation이 된 것을 확인 할 수 있다. 따라서 제일 효율적인 실험을 하려면 2Unit을 넣고 5분만 시간을 주어도 됨을 알 수 있다.]
6. Reference
분자생물학 제2판 / 박상대 / 라이프사이언스 / 2003. 2. 21
유전공학의 이해 / 남상욱, 권혁빈 / 라이프사이언스 / 2008. 7. 20
생물학 연구정보센터 http://bric.postech.ac.kr/
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학 번
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담당 교수님
(http://bric.postech.ac.kr/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=87142)
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ligation.html

키워드

DNA ligation,   분자유전학실험,   DNA