[미생물실험보고서] 현미경 사용법, 수생 미생물, 세균 수 관찰

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목차

1.현미경 사용법
2.수생 미생물 관찰
3.세균 수 측정

본문내용

알아보자
2) Hemocytometer를 이용해 현미경을 통해 육안으로 세균수를 측정해보자.
3) 분광광도계를 이용해 세균수를 측정해보자
재료 및 방법
-실험 재료
혈구계, 커버글라스, 스포이드, 미생물 배양액, 배지, 15㎖ 튜브, 분광 광도계
-혈구계를 이용해 세균수 측정하기
① 물 9㎖에 박테리아 현탁액 1㎖를 넣어 희석한다.
② 물 9900㎕에 위의 희석액을 100㎕를 넣어 희석한다.
③ 최종 희석액을 혈구계에 로딩하고, 현미경을 통해 관찰한다.
-분광광도계로 세균수 측정하기 & 알려진 데이터를 이용해서 세균수 예상하기
① 대장균 배양액(A) 1㎖를 스포이드를 이용해서 배지 1㎖에 넣는다.
② 스포이드로 희석액(B)를 흡입했다 방출하길 반복해서 잘 섞이도록 한다.
③ 이 희석액(B) 1㎖를 다시 배지 1㎖에 넣고, 잘 섞어준다.
④ 위와 같은 방식으로 희석액 (C),(D)를 만든다.
⑤ spectrophotometer를 이용해서 희석액 4개와 배양액, 배지의 분광도를 측정한다.
⑥ 측정된 희석액 (A), (B), (C), (D)의 분광도에서 배지의 분광도를 빼서 배지를 제외한 세균의 분광도를 구한다.
⑦ 이 데이터를 이용해서 x는 희석배율, y는 분광도의 그래프를 그리고 x,y의 방정식을 구한다.
⑧ 대장균의 경우 분광도가 0.2일 때, cloning forming unit의 값이
1×107 cfu/㎖임을 이용해서 위의 방정식의 희석 배율 얼마가 이에 해당하는지 구한다.
실험결과
-혈구계를 이용하여 세균수 측정하기
혈구계는 9개 큰 사각형 영역으로 나눠진다.
대각선 모서리에 있는 4개 영역을 A, B, C, D라고 하면, 세균수를 세기 위해서 A, B, C, D 영역의 세균수를 세서 평균을 구해준다.
각 영역의 작은 사각형에서 'ㄴ'을 그리면서 세면 쉽다.
(즉, A영역의 윗변, 오른쪽 변에 걸쳐있는 세균은 세지 않고 아랫변, 왼쪽 변에 걸쳐있는 세균은 센다. 빨간 표시를 참고)
이렇게 세면 세균이 A영역에 12개, B영역에 12개, C영역에 11개, D영역에 12개가 있다는 것을 알 수 있다.
A, B, C, D영역의 세균 수의 평균을 낸다.
영역 안의 세균 평균수 = (A + B + C + D)/4 = (12+12+11+12)/4 = 11.75 개
단위 영역 하나는 가로 1㎜, 세로 1㎜, 높이 0.1㎜이다.
즉, V = 1㎜ × 1㎜ × 0.1㎜ = 0.1 ㎜ = 10-4㎝ = 10-4 ㎖ 이다.
희석 비율은 희석액(C)= 희석액(B)×100㎕/10000㎕ , 희석액(B)= 현탁액(A)×1㎖/10㎖ 이므로 희석액(C)= 현탁액(A)×(100/10000)×(1/10) = 현탁액(A) × 1/1000 이다.
그러므로 현탁액 1㎖의 세균수 = 영역 안의 세균 수 × 104 ㎖-1× 1000 = 11.75 × 107 개/㎖
(한 영역이 10-4㎖ 였으므로 1㎖ 당 세균 수를 구하기 위해선 104을 곱해주고, 1/1000배 희석했으므로 원래 현탁액의 농도를 구하기 위해선 1000을 곱해준다.)
현탁액 10㎖의 세균 수를 측정하고자 하므로 우리가 구한 1㎖당 세균수에 10을 곱해서 구한다.
11.75 × 108 개
-분광 광도계를 이용해서 세균수 측정하기(1)
희석배율
원액(1)
배지
1/2
1/4
1/8
1/16
분광도
0.966
0.067
0.666
0.398
0.244
0.160
실제 분광도
(분광도 - 배지의 분광도)
0.966
-
0.599
0.331
0.177
0.093
측정한 분광도를 이용해 x를 희석배율, y를 분광도로 하는 이차 방정식을 구해본다.
대장균의 경우, 흡광도 0.2일 때,
CFU(cloning forming unit)은 1×107cfu/㎖이다.
y에 0.2를 대입하면 x = 0.1774가 나오는데 이 x값이 이 용액에서 세균수가 1×107cfu/㎖일 때의 희석배율이다.
① 희석 배율 1/16일 때 세균수 A는
0.1774 : 1/16 = 1×107 : A 로 구할 수 있다.
A = 3.5 × 106 cfu/㎖
② 희석 배율 1/8일 때 세균수 B는
0.1774 : 1/8 = 1×107 : B 로 구할 수 있다.
B = 7.0 × 106 cfu/㎖
③ 희석 배율 1/4일 때 세균수 C는
0.1774 : 1/4 = 1×107 : C 로 구할 수 있다.
C = 1.4 × 107 cfu/㎖
④ 희석 배율 1/2일 때 세균수 D는
0.1774 : 1/2 = 1×107 : D 로 구할 수 있다.
D = 2.8 × 107 cfu/㎖
⑤ 원액의 경우 세균수 X는
0.1774 : 1 = 1×107 : X 로 구할 수 있다.
X = 5.6 × 107 cfu/㎖
-분광 광도계를 이용해서 세균수 측정하기(2)
희석배율
배지
1/5
1/3
1
분광도
0.070
0.300
0.441
0.926
실제 분광도
(분광도 - 배지의 분광도)
-
0.230
0.371
0.926
y=0.2를 대입하면 x = 0.1678가 나오고 이는
희석배율 0.1678일 때 cfu는 1×107cfu/㎖란 의미다.
①희석 배율 1/5일 때 세균수 A는
0.1678 : 1/5 = 1×107 : A 로 구할 수 있다.
A = 1.2 × 107 cfu/㎖
②희석 배율 1/3일 때 세균수 B는
0.1678 : 1/3 = 1×107 : B 로 구할 수 있다.
B = 2.0 × 107 cfu/㎖
③원액의 경우 세균수 X는
0.1678 : 1 = 1×107 : X 로 구할 수 있다.
X = 6.0 × 107 cfu/㎖
토론
처음 분광 광도법에 대한 설명을 들었을 때 의아해했다. CFU라는 것이 갑자기 나타났기 때문이다. 하지만 곧 흡광도가 0.2일 때, 실험을 통해 얻은 대장균 세균수가 1×107cfu/㎖라는 것을 이해하게 되었다.
참고문헌
blog.naver.com/lekodanhong
Hemocytometer를 이용한 세포 계수법 (http://www.cyworld.com/annuri/2991219)
youtube.com에서 OlachiOleru가 올린 ‘how to use a hemecyometer’ 동영상 참고
신장(kidney) 조직
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