pcr DNA 추출,PCR의 원리 및 실험, 실험 재료

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pcr DNA 추출,PCR의 원리 및 실험, 실험 재료에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

. Washing
5. Elution
-PCR
1. PCR tube에 dNTPs buffer 4 μl와 reaction buffer 5 μl를 넣는다.
2. Template DNA 1 μl를 넣고 forward, reverse primer를 각각 0.5 μl 씩 넣는다.
3. DNA polymerase 1 μl를 넣는다.
4. 증류수 37 μl를 넣고 잘 pipetting 해 준다.
5. PCR machine의 well에 tube를 넣고 반응시킨다.
<실험 재료>
-PCR
DNA polymerase, Template DNA, primers, dNTPs mixture, Reaction buffer, PCR tube, 증류수, pipette tip, pipette

Plasmid DNA extraction
Plasmid를 분리해내는 방법은 추출량에 따라 miniprep, midiprep, maxiprep 이 있다.
기본적인 원리는 세균의 Cell wall을 Alkali lyssis method를 통해 깨부수고 DNA를 분리 한 후 다시 Chromosomal DNA와 plasmid DNA 중 plasmid만을 분리하는 것이다.
실험에 사용한 용액의 역할을 알아보도록 하자.
Solution I
Solution II
Solution III
50mM Glucose
25mM Tris-Cl (pH 8.0)
10mM EDTA (pH 8.0)
(autoclave)
0.2N NaOH (10N을 만들어 만들때마다 stock 해서 씀)
1%SDS (Fresh ,37℃ 보관)
5M Potassium acetate 60ml
Glacial acetic acid 11.5ml
DDW 28.5ml (4℃에서 보관)
Cell wall 깨버림
Cell membrane을 완전히 깨고 염기성인 NaOH가 DNA를 Denaturation 시킴
산성인 Glacial acetic acid가 DNA를 Renaturation 시킴
RNase를 넣어서 사용하기도 한다. RNase는 RNA를 부셔버리는 효소다.
SDS는 저온에서 결정을 만드므로 37℃에서 보관하도록 하고(Heating) NaOH는 공기에 노출되면 NaOH 의 농도가 떨어지므로 공기의 노출을 가급적이면 피하고 항상 Fresh 상태로 만들어 사용하도록 한다.
Solution III는 4℃에서 보관하도록 하는데 색깔시약은 주로 상온에서 날아가기 때문이다. 또 Solution III는 냄새가 많이 나기 때문에 저온에서 보관하는 것이 좋다.
Solution I 에 들어있는 EDTA가 세포벽의 Calcium ion을 제거하여 세포벽을 무너뜨린다. 하지만, 세포가 완전히 무너지면 DNA가 모두 빠져나오게 되므로 Solution I 에 있는 glucose가 삼투압을 유지시켜주어 세포의 외형을 유지시켜준다. 때에 따라선 lysozyme을 쓰기도 한다.
그 후 Solution II를 넣어주는데 Solution II 에 들어있는 SDS는 ionic detergent (계면활성제) 이다. Vortexing 같은 처리

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pcr DNA 추출,   PCR의 원리 및 실험 ,   DNA 추출