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DNA 조작 기술
- 플라스미드의 상업화
플라스미드는 거의 모든 유전자를 운반할 수 있고, 박테리아 내부에서 자신을 복제할 수 있기 때문에 재조합 DNA 기법에 매우 유용한 도구로 쓰인다.
① 미생물로부터 플라스미드를 분리한다.
② 동물, 식
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된 대장균에 plasmid DNA를 넣는 방법으로는 chemical method이 있는데 Chemical method는 보통 CaCl2를 사용하여 대장균 세포막의 DNA 투과성을 증가시키는 방법이다. 전기영동으로 알아보는 뿐만 아니라 이렇게 실험해서 결과를 알아보고싶다.
원심분리
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plasmid 를 추출하는 일반적인 방법
기본원리 세포내에 DNA는 일반적인 double-helix를 형태를 가지는 반면 plasmid는 supercoiled형태를 가짐으로써 PH의 변화에 따라서도 plasmid의 형태 와 구조가 크게 변하지 않는 것을 이용하여 순수한 plasmid만을 추출
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r 4 (10x)
2㎕
Mini-prep한 plasmid
10㎕
D.W
7㎕
Nde I
0.5㎕
Nco I
0.5㎕
2.1% agarose gel에서 전기영동하여 mini-prep한 plasmid의 size가 정확한지 확인한다.
(이 때, loading dye가 들어있지 않기 때문에, 반드시 DNA loading dye(6x)를 첨가한 후에, gel에 loading한다.)
※실험
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DNA polymerase, Template DNA, primers, dNTPs mixture, Reaction buffer, PCR tube, 증류수, pipette tip, pipette
<miniprep의 원리>
Plasmid DNA extraction
Plasmid를 분리해내는 방법은 추출량에 따라 miniprep, midiprep, maxiprep 이 있다.
기본적인 원리는 세균의 Cell wall을 Alkali lyssi
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있는데 이와 같이 외부 DNA를 직접 받는 경우를
형질전환이라 한다. 외부 DNA를 받아들일 수 있는 상태를 수용성이라 한다.P
lasmid DNA는 원형의 유전물질로 염색체와는 별개로 존재하며 자기복제가
가능한 염색체의 DNA이다. Plasmid가 갖는 유전
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하여 plasmid DNA의 농도가 작게 나온 경우를 생각해 볼 수 있다.
혹은 실험에서 사용한 단위인 ㎕이 굉장히 미세한 단위이므로 Micro pipette를 사용하는 과정에서의 약간의 오차가 실험의 결과에 크게 영향을 끼쳤을 경우도 있다.
위의 경우로 실
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DNA: pcr에서 증폭의 target이 되는 DNA로 모든 종류의 유전체, 플라스미드 DNA등이 사용된다.
DNA polymerase: DNA를 복제하는 효소로 Primer Extension 단계에서 dNTPs와 함께 넣어 Primer의 연장을 돕는다. TaqDNA polymerase는 THermus aquaticus에서 분리한 효소로 고온
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재조합 DNA가 실제로 들어간 박테리아만을 선별함.
4. DNA 문고(DNA library)
어떤 생명체의 모든 DNA(genome 전부)를 적당한 크기로 잘라서 클로닝을 위하여 보관한 것.
① DNA 추출 --> 제한효소 처리 --> DNA 조각을 박테리아 플라스미드에 삽입 -->
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DNA 추출과 PCR 과정에서 오류가 있었음을 알 수 있다.
Introduction
일반적으로 식물세포는 동물세포와 달리 세포벽을 가지고 있고, 식물 DNA는 plasmid DNA에 비해 대단히 크고 단백질과 RNA 등과 함께 복합체를 이루고 있어 그 추출에 상당한 주
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