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효소의 specific activity (U/mgenzyme )를 계산한다.
※ 실험 시 유의사항
- pNPB는 광분해될 수 있으므로 호일로 감싸야 한다.
- 흡광도 측정할 때 UV-Vis spectrophotometer에 외부 빛이 들어가지 않도록 한다.
- Sampling할 때 정확한 흡광도 측정을 위해 cuvette
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효소의 specific activity (U/mgenzyme )를 계산한다.
※ 실험 시 유의사항
- p-NPB는 광분해될 수 있으므로 호일로 감싸야 한다.
- 흡광도 측정할 때 UV-Vis spectrophotometer에 외부 빛이 들어가지 않도록 한다.
- Sampling할 때 정확한 흡광도 측정을 위해 cuvette
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isolation(Ammonium acetate 법
2. DNA Restriction (Vector 제작
3. pS44 DNA restriction
4. Electrophoresis
5. PCR (polymerase chain reaction
6. Elution ;Gene clean kitⅢ(Bio101
7. Ligation
8. Competent cell 제조 (DH5α) - CaCl2 법 사용
9. Transformation (Heat shock
10. screen
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PCR product는 selection plate 에 spread된 transformation culture에 존재하는 미량의 insert DNA에 의한 것이라 할 수 있다.
PCR시 product가 형성되는 결과를 나타낼수 있는 최소의 양을 확인하기 위해 template인 pf7 DNA를 4000, 400, 40, 4, 0.4pg으로 희석한 다음 Npf7과 C
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Restriction enzyme
※ Recombinant DNA
※ 제한효소 (restriction enzyme)
3) DNA ligation과 T-vector를 이용한 PCR product의 cloning
Ⅲ. 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입
1) Transformation
2) 항생제와 LacZ를 이용한 seletion
※ 항생제를 이용한 selection
LacZ를
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PCR 방법으로 증폭하기로 하고 primer design으로부터 시작하시오. Double restriction enzyme digestion을 하되, 이 방법이 사용 불가능할 경우는 single digestion 방법을 사용하시오. enzyme 선택의 이유도 제시하시오.
4. Transformation 후, screening 과정을 거처 bac
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효소
1) Type I restriction enzyme
2) Type II restriction enzyme
3) Type III restriction enzyme
■ 제한효소를 이용한 DNA의 절단
■ 전기영동 ( electrophoresis )
■ DNA 정량
(1) DNA의 농도측정 원리
(2) 분광광도계( Spectrophotometer)
4. 실험재료
5. 실험방법
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PCR & Agarose Gel Electrophoresis
3.21.~28.
Enzyme digestion & Gel extraction
4.4.
Ligation & Transformation
4.18.
Agarose gel electrophoresis & Confirm the plasmid DNA
4.25. 1. Plasmid Mini prep & PCR & Agarose Gel Electrophoresis
3.21.~28.
2. Enzyme digestion & Gel extraction
4.4.
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Transformation (using heat shock method)
ⓐ -80℃에서 보관한 competent cell을 ice에서 2~3min 넣어 녹임.
ⓑ clean bench에서 competent cell 100㎕을 따서 plasmid(vector) 10㎕에 넣고
tapping하고 ice에서 40min 대기.
⇒ competent cell : plasmid = 10 : 1. 이보다 클 경우 효율 낮아짐
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이용한다.
이번 실험에서는 T-DNA가 다른 genome에 삽입 되었는지와 몇 copy가 들어갔는지 확인하기 위해 Southern을 사용한다. Southern의 정의
Southern의 목적
Southern의 원리
Southern과 PCR의 비교
Southern의 응용
실험과정
실험 시 주의 사항
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