단백질(protein) 분석실험(전기영동포함)

소개글

단백질(protein) 분석실험(전기영동포함)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 실습 제목

2. 실습 목표

3. 실습 이론
1). Buffer
2). 세포의 파괴와 분획
3). 단백질의 가용화 법(막단밸질의 가용화 방법)
4). 단밸질 정량법(Bradford 법)
5). Polyacrylamide gel
(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis;SDS-PAGE)
6). 단백질의 염색

4. Procedure

5. Content of solutions & 그 용도

6. 실습 결과

7. Discusstion

본문내용

omassie briliant blue(CBB) dye로 염색한다.
①. Gel을 적어도 5배 부피에 해당하는 염색액에 담근 후 염색이 충분히 될 때까지 서서히 흔들어 준다.
②. 염색액을 제거한 후 탈색 용액(destaining solution)에 gel을 담가 두어 탈색시킨다.
③. 탈색용액을 여러 차례 갈아 주면서 band patterns를 관찰한다.
5. Content of solutions & 그 용도
homogenization buffer
20Mm Tris-Cl(pH 7.5)
pH buffer
150mM NaCl
Osmotic effect
2mM EDTA
+2 양이온과 결합
Degradation enzyme을 inhibition
lipid bilayer 파괴
1% Triton X-100
계면활성제
Bradford working sol.(/L)
850ml H20
50ml 95% ethanol
100ml 85% phosphoric acid
100mg coomassie briliant blue G
AA Lys에 결합하는 dye
1X SDS Gel-loading buffer(/L)
50mM Tris-Cl(pH 6.8)
14.4mM 2-mercaptoethanol
Disulfide bond 파괴
Protein의 unfolding
2% SDS
Protein folding 방지
0.1% bromophenol blue
전개시 표시를 해주는 dye
10% glycerol
용액에 잠기게 함
염색액(/L)
1g Coomassie Blue R-250
450ml methanol
450 H2O
100ml glacial acetic acid
탈색액(/L)
100ml methanol
100ml glacial acetic acid
800ml H2O
6. 실습 결과
1). 단백질의 정량
BSA 0
BSA 10㎕
BSA 20㎕
BSA 30㎕
Target protein
흡광도
0(0점기준)
0.674
1.053
1.264
0.832
BSA의 그래프 공식 : y=0.0417x+0.1221 (y : 흡광도, x : 농도)
R2=0.9411 일치도
Target protein(Spleen)의 농도 : 3.4㎍/㎕
2). SDS-PAGE
원래는 기준물질과 같이 전기영동해야 하는데, 기준물질이 다 떨어져서 그냥 Target protein만 전기영동하였다. 가장 오른쪽에 있는 band가 나의 Spleen의 band이다.
- Lung, Liver, Heart, Intestine, Spleen순이다.(좌에서 우로)
7. Discusstion
1). Target protein의 농도로 본 각 기관별 특성
Spleen
Lung
Liver
Heart
Intestine
농도(㎍/㎕)
3.4
2.24
9.08
3.73
1.62
- 역시 가장 두드러지는 것은 Liver이다. 이것은 Liver가 다른기관에 비해서 단백질의 비율이 월등히 높은 것을 의미한다. 즉, 간에서는 다른 신체구성요소인 Fat과 여러 Inorganic substances의 비율이 상대적으로 적고, 단백질의 비율이 많기 때문이다.
- 이에 비해서 Intestine 경우에는 다른기관에 비해서 단백질의 비율이 상당히 적다. 이는 다른 신체구성요소들이 상대적으로 많다는 것을 의미한다. 특히 Fat이 많을것으로 사료된다.
- 이에 비해서 나의 Target organ인 Spleen의 경우에는 특별히 단백질의 비율이 많은 것은 아니다.
2). SDS-PAGE로 본 기관별 상대적 특성
- 역시 기준물질의 표기되어 있지않아서 정량적인 분석은 불가능하지만, 상대적인 특성을 파악할 수는 있다.
① 모든 결과물에는 공통적인 Band가 가운데에 드러난다. 이는 모든 기관에는 공통적으로 존재하는 단백질이 있음을 말한다. 어떠한 단백질이 이렇게 주로 공통적으로 존재하는 것일까? 그것은 기본적으로 Intestium이나 Cell에 존재해야 하는 단백질일 것이다. 즉, 기본적으로 Cell skeleton이나, Cell membrane를 구성하는 단백질이나, Intestium를 구성하는 Proteoglycan과 같은 것을 추측할 수 있다. 그러나 각 기관별로 intestium의 비율이 다르므로 intestium의 경우에는 그 가능성이 낮다고 추측 할 수 있다.
② 각 결과물들은 전개가 된 정도와 Band가 나타나는 곳이 다르다. 즉, 이것은 각 결과물마다 구성하는 단백질의 종류와 분자량이 상당히 다르다는 것을 의미한다. 특히 Intestine과 Heart 경우에는 상당히 큰 분자량을 가지고 잇는 단백질이 많이 있다는 것을 의미 한다. 그리고 Band가 다르게 나타나는 것은 각 기관별로 구성하는 단백질이 다르다는 것을 의미한다. 각 기관별로 기능이 다른데에서 기인할 것이다.
3). Target Organ인 Spleen의 특성(조직학적인)
- Spleen은 꽉 쥔 주먹만한 크기의 가장 큰 면역기관으로 복강 내 위쪽 왼 사분역에 위치하고 혈액 분포가 풍부한 기관이다.
- 지라의 기능
. 면역계의 기능으로 B cell과 T cell의 활성화와 증식을 담당한다.
. 혈액으로부터 고분자 항원을 제거한다.
. 노쇄된 RBC를 제거한다.(Tissue Macrophage에 의해서)
. 초기 태생기 기간동안에 조혈기관으로 활동한다.
4). 기타
- 나는 이번 실험을 통해서 각 기관별 protein의 조성비율과 같은 실제적인 data를 얻을 수 있을 것이라고 생각하고, 각 기관별로 존재하는 protein의 구성비율에 대해서 조사해보려고 하였다. 하지만, 여러 자료를 찾아봐도 Protein에 관련된 것은 보통 protein의 형성과정이나 그 구조적인 형태나 기능에 관하여만 저술되어있었다. 각 기관별이나 조직별로 구성 Protein을 알려고 하면 어떠한 주제로 자료를 찾아야 할까?(조직학은 주로 현미경적 morphology만 중시하여 자세한 정보는 얻을 수 없었다.)
8. 참고자료
단백질 실험노트(상, 하) - 김승호, 장규태 역(월드사이언스)
실험생화학 - 대한생화학·분자생물학회
Histology - Michael H. Ross 저(군자 출판사)
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키워드

단백질,   protein,   전기영동,   단백질분석,   단백질정량,   SDS